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Artigo de método

Expressão transiente de proteínas por hidrodinâmica Gene Entrega em Ratos

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DOI:

10.3791/51481

⸱

5 de maio de 2014

 , 
1Department of Biological Sciences, Hunter College, CUNY

Neste artigo

Resumo

Na transfecção in vivo de ADN nu por entrega de genes hidrodinâmico apresenta genes no tecido de um animal com uma resposta inflamatória mínima. Uma quantidade suficiente de produto do gene são gerados de tal forma que a função do gene e regulação, bem como a estrutura e função da proteína pode ser analisado.

Resumo

Expressão eficiente de transgenes in vivo é de fundamental importância no estudo da função dos genes e desenvolvimento de tratamentos para doenças. Nos últimos anos, a entrega do gene hidrodinâmico (HGD) surgiu como um método simples, rápido, seguro e eficaz para a entrega de transgenes em roedores. Esta técnica baseia-se na força gerada pela rápida injecção de um grande volume de solução fisiológica para aumentar a permeabilidade das membranas celulares dos órgãos perfundidos e assim entregar o ADN em células. Uma das principais vantagens de HGD é a capacidade para introduzir os transgenes em células de mamíferos usando o DNA de plasmídeo despido (ADNp). A introdução de um gene exógeno usando um plasmídeo é minimamente trabalhoso, altamente eficiente e, ao contrário de transportadores virais, notavelmente segura. HGD foi inicialmente utilizado para entregar genes em ratos, é agora usado para proporcionar uma vasta gama de substâncias, incluindo oligonucleótidos, cromossomas artificiais, ARN, proteínas e pequenas moléculas em ratinhos, ratazanase, num grau limitado, de outros animais. Este protocolo descreve HGD em ratos e se concentra em três aspectos-chave do método que são fundamentais para realizar o procedimento com sucesso: correta inserção da agulha na veia, o volume de injeção ea velocidade de entrega. Os exemplos são apresentados para mostrar a aplicação deste método para a expressão transitória de dois genes que codificam para proteínas secretadas, primatas-específica, apolipoproteína LI (APOL-I) e proteína relacionada com haptoglobina (HPR).

Introdução

Desde sua primeira descrição por Liu et al. E Zhang et al., Entrega gene hidrodinâmico (HGD) tornou-se uma ferramenta valiosa para estudar a função do gene em roedores sistemas modelo 1, 2. A técnica envolve a injecção rápida (5-7 segundos) de um grande volume (8-12% de peso corporal) de solução para a veia da cauda dos ratinhos a fim de facilitar a absorção de ADN de plasmídeo por as células de órgãos alvo 1, 2. Estas condições conduzem a expressão do gene robusto no fígado e menos expressão do gene no rim, baço, pulmão e coração.

A injecção de 10 ug de pCMV-LacZ plasmídeo pode transfectar tanto como 40% dos hepatócitos, tornando HGD o mais eficiente, não-viral in vivo, o método de entrega de genes para uma data. Ao contrário dos portadores virais, pDNA é fácil de preparar, não provocar uma resposta imunológica no hospedeiro roedor 3 e não representa um risco para a saúde por meio da recombinação com finalvírus ogenous. Além disso, uma vez que as moléculas de ADN entregue por HGD não precisa de embalagem, este método é adequado para a entrega de cromossomas artificiais bacterianos (BAC) tão grandes como 150 kb 4. Outros tipos de moléculas que foram entregues por um método de hidrodinâmica incluem ARN 5-10, morfolinos 11, proteínas de 12, 13 e outras moléculas pequenas, 12, 14. As vantagens e desvantagens de HGD sobre outros métodos de entrega tem sido discutido em excelentes revisões na literatura 15-20 e um número de autores fornecida uma descrição detalhada do procedimento 21-23.

Introduzindo transgenes em murganhos por HGD é segura e eficaz 1-3, 24 e o método tem sido utilizado com sucesso em ratos comparáveis ​​25. Com certas modificações, as experiências de prova-de-conceito foram realizadas em 26 galinhas, rabBits 27 e 28 porcos, embora, a aplicação vivo no da técnica em animais maiores continua a ser um desafio. Ao utilizar este método, uma outra limitação é comum que muitos dos vectores de expressão de mamíferos disponíveis não possuem os componentes para realizar um persistente, elevado nível de expressão do gene. Usando um plasmídeo, a expressão do gene de pCMV-Luc em órgãos alvo é evidente tão cedo quanto 10 minutos após HGD, no entanto, o elevado nível inicial, a expressão cai drasticamente, na primeira semana após a injecção 1. A expressão do transgene a longo prazo, é possível, dependendo do promotor e o intrão utilizado na criação do plasmídeo 3, 24 injecções no entanto, a manutenção da expressão de genes de alto nível geralmente requer repetidas. Por esta razão, HGD pode ser menos adequado para estudar doenças crônicas, que são resultado de exposição a longo prazo às proteínas prejudiciais ou produtos de proteína. Com estas limitações, HGD é uma ferramenta extremamente poderosa para estudar a pocial papel de um gene e o efeito de que os mutantes in vivo, bem como os efeitos terapêuticos e regulação de proteínas e para o estabelecimento de modelos animais da doença (para uma revisão, ver 15). Por exemplo, HGD pode ser utilizado para designar uma função de domínios e aminoácidos de proteínas através da introdução de várias construções de gene individualmente em ratinhos que têm os respectivos genes batido para fora. Além disso, esta técnica pode ser usada em qualquer estirpe de ratinho.

Este protocolo descreve HGD em ratos com um foco sobre os aspectos técnicos necessários para alcançar a transfecção de sucesso: a inserção da agulha correta para a veia, o volume de injeção e velocidade de entrega. A aplicação deste método é demonstrado em um modelo do rato da tripanossomíase Africano, uma doença fatal dos seres humanos e de animais 29, 30. Enquanto várias espécies de tripanossomas causar doenças em animais, a maioria não pode causar a doença em humanos devido à inata complexos imunes em blood chamados fatores líticas tripanossomas (Tlfs) 29, 31, 32. Estes, lipoproteínas de alta densidade que formam poros (HDL) contêm dois, proteínas primatas específicas exclusivas:. HPR, o ligante, o que facilita a captação de FPTs em tripanossomas e APOL-I, o componente lítica 31, 33-38 Trypanosoma brucei rhodesiense é capaz de infectar seres humanos, devido à expressão de uma proteína associada a resistência soro (SRA), que se liga e neutraliza humano APOL-I 34, 39. Babuíno TLF não é neutralizado por SRA, devido à sua divergente APOL-I da proteína 40. Como relatado anteriormente, utilizando um vector de expressão de mamífero (pRG977), a expressão transgénica do babuíno componentes TLF em ratinhos confere protecção contra tripanossomas humanos-infeccioso 40. Os dados representativos aqui apresentados demonstram como a entrega do gene hidrodinâmico pode ser aplicado para estudar os efeitos terapêuticos de uma proteína.

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Protocolo

Todos os experimentos aqui descritos foram aprovados pelo Comitê Animal Care Institucional e Uso do Hunter College, Universidade da Cidade de Nova York.

1. Preparação de ADN plasmídico sem endotoxinas

  1. Escolha de uma única colónia de bactérias, contendo o gene de interesse num vector de expressão de mamífero a partir de uma placa recentemente riscada selectiva.
  2. Siga as recomendações encontradas no manual de um kit disponível comercialmente purificação plasmídeo livre de endotoxina para cultivo e colheita bactérias.
  3. Purifica-se o plasmídeo de ADN livre de endotoxinas a partir de células bacterianas, seguindo o protocolo do kit de purificação de plasmídeo isento de endotoxina disponível comercialmente.
  4. Use livre de endotoxina plásticas e lidar com DNA com cuidado para garantir que a endotoxina não é re-introduzida na amostra de DNA após a etapa de remoção.
  5. Medir a concentração de DNA plasmídico sem endotoxinas por determinação da sua absorvância a 260 nm usando um micro-volume do espectrofotómetro de UV, como descrito abaixo, ou um padrão, baseada em espectrofotômetro cuvete.
    1. Limpar as superfícies ópticas inferiores e superiores do sistema de retenção de amostra espectrofotômetro micro como se segue. Pipetar 1 mL de água deionizada limpo no sistema óptico menor. Feche o braço de alavanca e toque-o algumas vezes para banhar o sistema óptico superior, em seguida, alavanca de abertura e limpe com um lenço de papel.
    2. Abra o software do micro espectrofotómetro e seleccionar o módulo de ácidos nucleicos.
    3. Coloque 1 ml de água deionizada limpa no sistema óptico inferior, o braço de alavanca e selecione "inicializar" do software do programa. Uma vez que a inicialização estiver superfícies completas, limpas tanto ópticos com um lenço de papel ..
    4. Executar a medição em branco, carregando um ul de tampão TE isento de endotoxina (10 mM Tris-Cl, pH 8,0; EDTA 1 mM) e seleccionando "em branco" do software do programa. Uma vez que a medição é feita em branco, superfícies limpas tanto ópticos com umtecido.
    5. Realizar medição da amostra, carregando 1 ml de amostra de DNA livre de endotoxina e selecionando "medida" do software do programa. Registre a concentração de DNA. Avaliar a pureza do DNA através da gravação da relação absorbância 260/280 nm que aparece na tela. Uma vez que o uso de ADN puro (260/280 razão de 1,8) para HGD é altamente desejável, evitar a utilização de uma amostra de DNA com uma razão de 260/280 inferior a 1,7. Uma vez que a medição é feita, limpar ambas as superfícies ópticas com um tecido.

2. Pesando de ratos

  1. Mark camundongos em uma forma apropriada para a tensão. Nota: marcação da cauda não é recomendado para este procedimento.
    1. Marcar espécie de rato que têm pele branca (por exemplo, Swiss Webster) em suas costas com um marcador preto. Reaplicar marcas ao longo do tempo, se necessário.
    2. Mark espécie de rato que têm pele preta (por exemplo, C57BL / 6) pela orelha perfurando vários dias de antecedência.
  2. Pesar camundongos individually delicadamente colocando-os em um prato de pesagem ou animal balde colocado em uma balança de laboratório digital. Registar o peso de cada murganho utilizado na experiência, no dia da experiência.

3. Preparação de seringas

  1. Preparação da mistura de injeção
    1. Calcula-se a quantidade de DNA necessária, assumindo 5 - 50 ug livre de endotoxina plasmídeo de DNA para a injecção de cada rato.
      1. Determinar a quantidade óptima de DNA de plasmídeo experimentalmente.
      2. Ao determinar a quantidade de DNA necessário, assumir a injeção de um rato adicional por grupo, como o carregamento adequado das seringas vai exigir algum mix injeção extra. Para ajudar os cálculos, considere o seguinte exemplo: injetar 4 camundongos experimentais e 4 de controle, cada um pesando 25 g, com 50 mg de plasmídeo de DNA por mouse. Para determinar a quantidade de DNA necessária neste caso, calcular com cinco ratinhos por grupo de: 5 x 50 mg = 250 ug de ADN necessário para cada grupo.
    2. Determinar a quantidade de soro fisiológico (cloreto de sódio a 0,9%) necessária, assumindo 10% do peso do corpo para a injecção de cada rato.
      1. De acordo com o exemplo acima, injecta-se 25 g de cada ratinho, com 50 ug de DNA de plasmídeo em 2,5 ml de solução salina (2,5 g de líquido).
      2. Ao determinar a quantidade de soro necessária para todo um grupo de ratinhos, assumir a injecção de um rato por grupo adicional para permitir a colocação adequada das seringas. Considerando-se a experiência dada, calcular a quantidade de soro necessária para 5 ratinhos em cada grupo: 5 x 2,5 ml = 12.5 ml de solução salina por cada grupo (ou 25 ml no total). Nota: Se os ratos pertencentes ao mesmo grupo não são o mesmo peso (diferença de mais de 10% do peso corporal), preparar injecção mistura separadamente.
    3. Use conservantes e sem endotoxinas solução salina, estéril, que foi aprovado para uso humano, em 10 ml, frascos de uso múltiplo.
    4. Utilizando uma agulha de calibre 20 (0.9 mm x 25 mm) acoplada a uma ponta luer de uma seringa de 20 ml,retirar o líquido a partir de frascos de soro fisiológico e esvaziar as seringas para um tubo cónico de 50 ml. Para ajudar a pipetagem precisa de solução salina, durante a preparação das misturas de injecção de DNA com solução salina, solução salina recolher mais do que o necessário para a injecção de todos os ratinhos na experiência. Para o experimento acima, retirar salina de 3 frascos de 10 ml (um total de cerca de 30 ml), mesmo que o valor calculado de soro necessário para a experiência é de apenas 25 ml.
    5. Pipetar a quantidade calculada de DNA em um tubo de 50 ml diferente. Tome cuidado para não tocar no lado do tubo com o corpo da pipeta para evitar a introdução de endotoxina. De acordo com o exemplo, uma pipetagem de 250 ug de controlo e 250 ug de DNA do plasmídeo experimental em tubos cónicos separadas.
    6. Adicionar a quantidade necessária de solução salina para o ADN utilizando uma pipeta serológica. Considerando a experiência da amostra, pipeta 12,5 ml de solução salina a cada uma das misturas mestres (experimental e controle).
    7. Permitir todas as soluções para alcançartemperatura ambiente antes da injecção.
  2. Preparação de seringas
    1. Para cada rato, preencher um, 3 ml, a seringa luer-lock esterilizado com a mistura de ADN-salina estéril usando uma agulha de calibre 20 (0.9 mm x 25 mm). Tome cuidado para evitar bolhas de ar. Evitar o uso de seringas de volume mais elevadas que a taxa de fluxo de injecção não pode ser controlada muito bem, e é difícil de manipular as seringas maiores em um lado. Ejetar qualquer mistura DNA-salina em excesso de volta para o tubo cônico, pois isso pode ser reutilizado.
    2. Mudar a agulha a uma estéril, agulha de calibre 27. Encha a agulha com o líquido completamente sem a introdução de bolhas de ar. Ajustar o volume da mistura de ADN-salina como calculada com base no peso do rato.
    3. Não permita que a agulha desencapada para tocar em qualquer superfície não-estéril. Se necessário, as agulhas podem ser re-tampado, utilizando a técnica com uma só mão: coloque a tampa sobre uma superfície plana, insira a agulha sem segurar a tampa com a outra mão e pressione a agulha tampadacontra um objecto firme para fixar a tampa para a agulha. As seringas estão agora prontos para injectáveis-veia da cauda.

4. Entrega DNA hidrodinâmica

  1. Note-se que os ratos a anestesia podem reduzir a viabilidade. Evite realizar HGD em uma sala que é muito frio, pois isso também vai reduzir a viabilidade. Se a sala tem uma temperatura ambiente de 20 ° C ou se estiver usando anestesia, coloque os ratos em uma almofada de aquecimento fixada em 37 ° C pós procedimento para evitar a perda de quaisquer animais. Se estiver usando anestesia, garantir que a boca e focinho do mouse são enquanto desobstruída na almofada de calor e observe o mouse até que recupere totalmente. Não reter água ou comida dos ratos antes de HGD.
  2. Aqueça os ratos para dilatar os vasos sanguíneos.
    1. Coloque a gaiola do rato (com cama incluídos) sobre uma almofada de aquecimento durante 5 minutos de modo que a temperatura do leito é de cerca de 38-39 ° C. A temperatura deve ser baixa o suficiente para manter os ratos na almofada de calor para umperíodo prolongado.
    2. Alternativamente, coloque o mouse em um limitador de acesso dorsal com restrição mínima. Aqueça a cauda do rato por 1 min delicadamente segurando-a com um pedaço de gaze umedecida em água morna. Permitir mouse para reposicionar, se necessário. Seque a cauda com um lenço de papel para secar.
    3. Alternativamente, rato quente, colocando a gaiola sob uma lâmpada de calor para não mais de 2 min. Se estiver usando uma lâmpada de calor, tenha cuidado para evitar o superaquecimento do mouse.
  3. Grande volume de injecção na veia da cauda
    1. Imobilizar um acesso restrainer dorsal sobre uma superfície plana por fita laboratório.
    2. Segurando pela cauda, ​​coloque o mouse suavemente para o limitador e insira a ficha. Usar a menor quantidade de retenção como necessário para manter a cauda imobilizada. Certifique-se de que o mouse está respirando livremente.
    3. Se o mouse está em perigo grave a qualquer momento durante o procedimento, remova o mouse do limitador imediatamente e deixe-a descansar.
    4. Posicione o mouse parauma das veias caudal lateral é visível. Localizar as veias caudais laterais pelo olhar directamente para baixo, para a parte traseira do rato: a linha vermelha em execução no meio da cauda é uma artéria, enquanto que as linhas azuis em ambos os lados da cauda são as veias caudais laterais.
    5. Limpe a cauda do rato cuidadosamente com um algodão embebido em álcool.
    6. Usando a mão não injetáveis, segure a cauda com força entre os dedos indicador e médio, de modo que a cauda passa sob o dedo indicador, mais de meio e terceiro dedos e sob o dedo mindinho. Permitir que o polegar para permanecer livre para se mover. (Figura 1A)
    7. Com a outra mão, limpe a área a ser injetado novamente com um algodão embebido em álcool. Permitir que a área seque.
    8. Pegue a seringa carregada com a mão-de injecção e segurá-la por barril entre o polegar e os outros quatro dígitos. Não se agarre o êmbolo.
    9. Colocar a seringa de paralelo para a cauda com a agulha apontando para o corpo do rato eo bisel (borda inclinada) da agulha virado para cima.
    10. Insira a agulha na veia da cauda. Continuar com a injecção apenas se a veia está localizada correctamente, o que é evidente a partir da agulha deslizante em qualquer resistência. Note-se que a profundidade de inserção da agulha é uma matéria de preferência pessoal no entanto, a inserção completa não é recomendada devido a um risco aumentado de ruptura da veia. Evite mover a agulha.
    11. Usando o polegar da mão-holding cauda, ​​fechar-se no centro da agulha e pressione hub contra a cauda para manter a agulha na posição. Não aplique pressão extrema e não se apegar eixo da agulha, como estes irão impedir o fluxo de líquido na veia. Segurar a cauda com o dedo indicador frouxamente neste ponto de modo a não impedir a injecção (Figura 1A).
    12. Re-posicione a mão segurando uma seringa de modo que o dedo indicador eo dedo médio estão segurando o flange eo polegar está na extremidade do êmbolo (Figure 1A).
    13. Pressionar para baixo sobre o êmbolo de um, um movimento contínuo e de injectar o volume total de líquido em 6-8 seg.
    14. Retire a agulha da veia e parar o sangramento aplicando pressão suave para a cauda com um tecido.
    15. Remover mouse do limitador e local rato em uma gaiola de recuperação colocado em cima de uma almofada de aquecimento (roupa de cama deve ser 37-38 ° C). Se a sala de injeção é frio, esta etapa é fundamental para a sobrevivência do mouse. Segure a cauda do rato até que o sangramento parar completamente.
    16. Observe o mouse por 1 hora após o parto DNA hidrodinâmico. Um período inicial de respiração ofegante e imobilidade é normal devido à arritmia temporária causada por HGD mas certifique-se que o rato mostra sinais de recuperação em cerca de 5 min. Se a respiração do mouse torna-se extremamente superficial, massageie suavemente o abdome do mouse para facilitar a respiração. Observam que a taxa de recuperação pode ser ligeiramente influenciada pela estirpe de ratinho utilizada.
    17. Voltar ratoa gaiola de habitação e garantir que o mouse tem uma abundante oferta de alimentos e água.
  4. Grande volume de injeção na veia da cauda usando uma posição alternativa mão
    1. Coloque o mouse no limitador e se preparar para injeção seguindo os passos 4.3.1 através 4.3.5, conforme descrito anteriormente.
    2. Descanse a mão não injetáveis ​​em uma superfície plana, com quatro dedos dobrados em um ângulo de noventa graus. Os dedos (todos excepto o polegar) deve assentar em cima uns dos outros, criando uma plataforma. Segure a cauda do rato entre o polegar eo dedo indicador (Figura 1B).
    3. Com a outra mão, limpe a área a ser injetado novamente com um algodão embebido em álcool. Permitir que a área seque.
    4. Agarrar a seringa com a mão-de injecção e segurá-la até ao rebordo e a extremidade do êmbolo, pronto para injecção.
    5. Conclua o procedimento, seguindo este protocolo a partir do passo 4.3.9 até a etapa 4.3.17, conforme descrito anteriormente.

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Resultados

O posicionamento correcto da agulha na veia da cauda do rato (conforme ilustrado na Figura 1) é um pré-requisito para o sucesso de entregar um transgene através de transfecção à base de hidrodinâmica. Muitas vezes, a parte mais difícil da técnica, no entanto, é a retenção da agulha dentro da veia da cauda, ​​sem movimento, de modo que todo o volume de injecção pode ser entregue dentro de um período de 6-8 s. Os pequenos erros durante o processo de injeção pode resultar em muito reduzida eficiência de tr...

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Discussão

Quando realizada corretamente, HGD é um meio extremamente eficaz e segura de entrega transgene. Os passos críticos para o sucesso do HGD são: 1) fornecer a quantidade certa de ADN em um grande volume de veículo salino 2) na veia da cauda do rato 3) em menos de 8 segundos.

Embora o próprio processo de injecção inegavelmente requer alguma destreza manual, o sucesso deste procedimento de seis segunda encontra-se frequentemente em uma preparação cuidadosa da experiência. A quantidade de ADNp nec...

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Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Agradecemos Xia Liu (Regeneron Pharmaceuticals) para, inicialmente, nos ensinando a técnica HGD e Dr. Russell Thomson (Albert Einstein College of Medicine), por sua orientação contínua em vários aspectos da tecnologia. Este trabalho foi financiado pelo Hunter College, CUNY arranque fundos e prêmio NSF Pão IOS-1249166. Agradecemos o apoio Grant NYULMC Histopatologia Núcleo NYUCI Center, NIH / NCI 5 P30CA16087-31 para histologia em fígado de camundongos.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Toalhete de Preparação de ÁlcoolWebcol6818
AST kit, Amplite ColorimetricAAT Bioquest13801
Tubo Cônico, 50 mlBD Falcon352070
EndoFree Plasmid Maxi KitQiagen12362
KimWipesKIMTECH34120
Iluminador de Cauda de MouseBraintree ScientificMTI RSTOu equivalente
Agulha, 20 Gx 1 (0.9mmx25mm)BD305175
Agulha, 27 Gx 1/2 (0.9mmx25mm)BD305109
pRG977 (vetor de expressão de mamíferos)Regeneron PharmaceuticalsAcordo de Transferência de Material necessário
Cloreto de Sódio, 0.9% INJ USP 10 ml, Hospira SeringaFisher NC9054335
, 3 ml, ponta Luer-LokBD309657Luer Lock necessária para suportar a pressão do HGD

Referências

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