Expressão transiente de proteínas por hidrodinâmica Gene Entrega em Ratos

Resumo

Na transfecção in vivo de ADN nu por entrega de genes hidrodinâmico apresenta genes no tecido de um animal com uma resposta inflamatória mínima. Uma quantidade suficiente de produto do gene são gerados de tal forma que a função do gene e regulação, bem como a estrutura e função da proteína pode ser analisado.

Resumo

Expressão eficiente de transgenes in vivo é de fundamental importância no estudo da função dos genes e desenvolvimento de tratamentos para doenças. Nos últimos anos, a entrega do gene hidrodinâmico (HGD) surgiu como um método simples, rápido, seguro e eficaz para a entrega de transgenes em roedores. Esta técnica baseia-se na força gerada pela rápida injecção de um grande volume de solução fisiológica para aumentar a permeabilidade das membranas celulares dos órgãos perfundidos e assim entregar o ADN em células. Uma das principais vantagens de HGD é a capacidade para introduzir os transgenes em células de mamíferos usando o DNA de plasmídeo despido (ADNp). A introdução de um gene exógeno usando um plasmídeo é minimamente trabalhoso, altamente eficiente e, ao contrário de transportadores virais, notavelmente segura. HGD foi inicialmente utilizado para entregar genes em ratos, é agora usado para proporcionar uma vasta gama de substâncias, incluindo oligonucleótidos, cromossomas artificiais, ARN, proteínas e pequenas moléculas em ratinhos, ratazanase, num grau limitado, de outros animais. Este protocolo descreve HGD em ratos e se concentra em três aspectos-chave do método que são fundamentais para realizar o procedimento com sucesso: correta inserção da agulha na veia, o volume de injeção ea velocidade de entrega. Os exemplos são apresentados para mostrar a aplicação deste método para a expressão transitória de dois genes que codificam para proteínas secretadas, primatas-específica, apolipoproteína LI (APOL-I) e proteína relacionada com haptoglobina (HPR).

Introdução

Desde sua primeira descrição por Liu et al. E Zhang et al., Entrega gene hidrodinâmico (HGD) tornou-se uma ferramenta valiosa para estudar a função do gene em roedores sistemas modelo ^{1, 2.} A técnica envolve a injecção rápida (5-7 segundos) de um grande volume (8-12% de peso corporal) de solução para a veia da cauda dos ratinhos a fim de facilitar a absorção de ADN de plasmídeo por as células de órgãos alvo ^{1, 2.} Estas condições conduzem a expressão do gene robusto no fígado e menos expressão do gene no rim, baço, pulmão e coração.

A injecção de 10 ug de pCMV-LacZ plasmídeo pode transfectar tanto co....

Protocolo

Todos os experimentos aqui descritos foram aprovados pelo Comitê Animal Care Institucional e Uso do Hunter College, Universidade da Cidade de Nova York.

1. Preparação de ADN plasmídico sem endotoxinas

1. Escolha de uma única colónia de bactérias, contendo o gene de interesse num vector de expressão de mamífero a partir de uma placa recentemente riscada selectiva.
2. Siga as recomendações encontradas no manual de um kit disponível comercialmente purificação plasmídeo livre de endotoxina para cultivo e colheita bactérias.
3. Purifica-se o plasmídeo de ADN livre de endotoxinas a partir de células bacterianas, seguindo o....

Resultados

O posicionamento correcto da agulha na veia da cauda do rato (conforme ilustrado na Figura 1) é um pré-requisito para o sucesso de entregar um transgene através de transfecção à base de hidrodinâmica. Muitas vezes, a parte mais difícil da técnica, no entanto, é a retenção da agulha dentro da veia da cauda, ​​sem movimento, de modo que todo o volume de injecção pode ser entregue dentro de um período de 6-8 s. Os pequenos erros durante o processo de injeção pode resultar em muito reduzida eficiência de tr.......

Discussão

Quando realizada corretamente, HGD é um meio extremamente eficaz e segura de entrega transgene. Os passos críticos para o sucesso do HGD são: 1) fornecer a quantidade certa de ADN em um grande volume de veículo salino 2) na veia da cauda do rato 3) em menos de 8 segundos.

Embora o próprio processo de injecção inegavelmente requer alguma destreza manual, o sucesso deste procedimento de seis segunda encontra-se frequentemente em uma preparação cuidadosa da experiência. A quantidade de ADNp nec.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Toalhete de Preparação de Álcool	Webcol	6818
AST kit, Amplite Colorimetric	AAT Bioquest	13801
Tubo Cônico, 50 ml	BD Falcon	352070
EndoFree Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12362
KimWipes	KIMTECH	34120
Iluminador de Cauda de Mouse	Braintree Scientific	MTI RST	Ou equivalente
Agulha, 20 Gx 1 (0.9mmx25mm)	BD	305175
Agulha, 27 Gx 1/2 (0.9mmx25mm)	BD	305109
pRG977 (vetor de expressão de mamíferos)	Regeneron Pharmaceuticals		Acordo de Transferência de Material necessário
Cloreto de Sódio, 0.9% INJ USP 10 ml, Hospira	Seringa	Fisher NC9054335
, 3 ml, ponta Luer-Lok	BD	309657	Luer Lock necessária para suportar a pressão do HGD