Espressione transiente di proteine da parte idrodinamica Gene Consegna in topi
Summary
In trasfezione in vivo di DNA nudo dal gene delivery idrodinamico introduce geni nel tessuto di un animale con risposta infiammatoria minima. Quantità sufficiente di prodotto genico sono generate in modo tale che la funzione del gene e la regolazione così come la struttura e la funzione della proteina possono essere analizzati.
Abstract
Espressione efficace dei transgeni in vivo è di fondamentale importanza nello studio funzione del gene e lo sviluppo di trattamenti per le malattie. Negli ultimi anni, la consegna del gene idrodinamico (HGD) è emersa come un metodo semplice, veloce, sicuro ed efficace per la consegna di transgeni in roditori. Questa tecnica si basa sulla forza generata dalla iniezione rapida di un gran volume di soluzione fisiologica per aumentare la permeabilità delle membrane cellulari di organi perfusi e quindi consegnare DNA nelle cellule. Uno dei principali vantaggi del HGD è la possibilità di introdurre transgeni in cellule di mammifero usando nuda DNA plasmidico (pDNA). L'introduzione di un gene esogeno utilizzando un plasmide è minimamente laborioso, altamente efficiente e, contrariamente ai vettori virali, notevolmente sicuro. HGD è stato inizialmente utilizzato per trasportare i geni nei topi, è ora utilizzato per fornire una vasta gamma di sostanze, tra cui oligonucleotidi, cromosomi artificiali, RNA, proteine e piccole molecole in topi, rattie, in misura limitata, altri animali. Questo protocollo descrive HGD nei topi e si concentra su tre aspetti fondamentali del metodo che sono fondamentali per eseguire la procedura correttamente: corretto inserimento dell'ago nella vena, il volume di iniezione e la velocità di consegna. Esempi sono forniti per mostrare l'applicazione di questo metodo per l'espressione transiente dei due geni che codificano proteine secrete, specifico primate-, apolipoproteina LI (APOL-I) e proteine aptoglobina correlata (HPR).
Introduction
Fin dalla sua prima descrizione da Liu et al. Ed Zhang et al., Consegna del gene idrodinamico (HGD) è diventato uno strumento prezioso per studiare la funzione del gene in sistemi modello roditore 1, 2. La tecnica prevede l'iniezione rapida (5-7 sec) di un grande volume (8-12% del peso corporeo) di soluzione nella vena caudale di topi per facilitare l'assorbimento di DNA plasmidico da cellule di organi bersaglio 1, 2. Queste condizioni portano ad espressione genica robusta nel fegato e meno espressione genica nel rene, milza, polmone e cuore.
Iniezione di 10 mg pCMV-LacZ plasmide può trasfettare fino al 40% degli epatociti, rendendo il HGD non virale in vivo metodo più efficiente, il trasferimento genico ad oggi 1. A differenza di vettori virali, pDNA è facile da preparare, non suscitare una risposta immunitaria nell'ospite roditore 3 e non costituisce un rischio per la salute ricombinando con finevirus esogeni. Inoltre, poiché le molecole di DNA forniti da HGD non necessitano imballaggio, questo metodo è adatto per la consegna dei cromosomi batterici artificiali (BAC) grandi come 150 kb 4. Altri tipi di molecole che sono state fornite da un metodo idrodinamico includono RNA 5-10, Morpholinos 11, proteine 12, 13 e altre piccole molecole 12, 14. I vantaggi e gli svantaggi di HGD rispetto ad altri metodi di consegna sono stati discussi in eccellenti recensioni in letteratura 15-20 e un certo numero di autori hanno fornito una descrizione dettagliata della procedura 21-23.
Introdurre transgeni in topi da HGD è sicuro ed efficace 1-3, 24 e il metodo è stato utilizzato in ratti con successo paragonabile 25. Con alcune modifiche, proof of concept esperimenti sono stati condotti in polli 26, rabi bit 27 e 28 suini, anche se, l'applicazione in vivo di questa tecnica in animali più grandi rimane una sfida. Quando si utilizza questo metodo, un altro limite comune è che molti dei vettori di espressione di mammifero disponibili mancano i componenti per realizzare una persistente, elevato livello di espressione genica. Utilizzando un plasmide, espressione genica pCMV-Luc in organi bersaglio è evidente già dieci minuti dopo HGD, tuttavia, il livello di espressione iniziale elevato scende bruscamente nella prima settimana dopo l'iniezione 1. Espressione del transgene a lungo termine è possibile a seconda del promotore e introni utilizzato nella progettazione plasmide 3, 24 iniezioni tuttavia, manutenzione di espressione genica di alto livello spesso richiede ripetuti. Per questo motivo, HGD potrebbe essere meno adatto per studiare le malattie croniche che sono il risultato di esposizione a lungo termine alle proteine dannose o prodotti proteici. Con queste limitazioni, HGD è uno strumento estremamente potente per studiare il Poziale ruolo di un gene e l'effetto di essa mutanti in vivo, così come gli effetti terapeutici e regolazione delle proteine e per la creazione di modelli animali di malattia (per una rassegna, si veda 15). Ad esempio, HGD può essere utilizzato per assegnare funzioni ai domini e aminoacidi di proteine introducendo singolarmente vari costrutti genici in topi che hanno i rispettivi geni messo fuori. Inoltre, questa tecnica può essere utilizzata in qualsiasi ceppo di topi.
Questo protocollo descrive HGD in topi con un focus sugli aspetti tecnici necessari per raggiungere trasfezione di successo: corretto inserimento ago nella vena, volume di iniezione e la velocità di consegna. L'applicazione di questo metodo è dimostrato in un modello murino di tripanosomiasi africana, una malattia fatale di esseri umani e animali 29, 30. Mentre diverse specie di trypanosomes causano malattie nel bestiame, la maggior parte non può causare malattie negli esseri umani a causa di complessi immuni innate in blood chiamate fattori litici tripanosoma (TLFs) 29, 31, 32. Questi, lipoproteine ad alta densità formanti pori (HDL) contengono due uniche, specifiche primate-proteine:. HPR, il ligando, che facilita l'assorbimento di TLFs in trypanosomes e APOL-I, la componente litica 31, 33-38 Trypanosoma brucei rhodesiense è in grado di infettare gli esseri umani a causa di espressione di una resistenza associata proteine del siero (SRA) che si lega e neutralizza umano APOL-I 34, 39. Baboon TLF non è neutralizzato da SRA grazie alla sua divergente APOL-I proteica 40. Come riportato in precedenza, utilizzando un vettore di espressione di mammifero (pRG977), espressione transgenica di babbuino componenti TLF nei topi conferisce protezione contro trypanosomes umane-infettivi 40. I dati rappresentativi presentati dimostrano come gene delivery idrodinamico può essere applicato per studiare gli effetti terapeutici di una proteina.
Protocol
Representative Results
Discussion
Quando eseguito correttamente, HGD è un mezzo straordinariamente efficace e sicuro di consegna transgene. I passaggi critici di successo HGD sono: 1) fornire la giusta quantità di DNA in un grande volume di soluzione salina veicolo 2) nella vena della coda del topo 3) in meno di 8 sec.
Sebbene il processo di iniezione stesso richiede innegabilmente una certa destrezza manuale, il successo di questa procedura sei secondi si trova spesso in preparazione accurata dell'esperimento. La quan…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Xia Liu (Regeneron Pharmaceuticals) per averci insegnato inizialmente la tecnica HGD e il dottor Russell Thomson (Albert Einstein College of Medicine) per la sua continua guida in vari aspetti della tecnologia. Questo lavoro è stato finanziato da Hunter College, CUNY start up fondi e premio NSF Pane IOS-1249166. Ringraziamo il NYULMC Istopatologia Nucleo NYUCI Support Center Grant, NIH / NCI 5 P30CA16087-31 per l'esame istologico sui fegati di topo.
Materials
| Alcohol Prep Wipe | Webcol | 6818 | |
| AST kit, Amplite Colorimetric | AAT Bioquest | 13801 | |
| Conical Tube, 50 ml | BD Falcon | 352070 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| KimWipes | KIMTECH | 34120 | |
| Mouse Tail Illuminator | Braintree Scientific | MTI RST | Or equivalent |
| Needle, 20 Gx 1 (0.9mmx25mm) | BD | 305175 | |
| Needle, 27 Gx 1/2 (0.9mmx25mm) | BD | 305109 | |
| pRG977 (mammalian expression vector) | Regeneron Pharmaceuticals | Material Transfer Agreement required | |
| Sodium Chloride, 0.9% INJ USP 10 ml, Hospira | Fisher | NC9054335 | |
| Syringe, 3ml, Luer-Lok Tip | BD | 309657 | Luer Lock necessary to withstand pressure from HGD |
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