Expresión transitoria de proteínas por hidrodinámico entrega de genes en ratones
Summary
En la transfección in vivo de ADN desnudo por la entrega de genes hidrodinámico introduce genes en el tejido de un animal con una respuesta inflamatoria mínima. Cantidades suficientes de producto génico se generan de tal manera que la función y regulación, así como la estructura y la función de la proteína del gen pueden ser analizados.
Abstract
La expresión eficiente de los transgenes in vivo es de importancia crítica en el estudio de la función génica y el desarrollo de tratamientos para las enfermedades. En los últimos años, la entrega de genes hidrodinámico (DAG) ha emergido como un método sencillo, rápido, seguro y eficaz para la entrega de transgenes en roedores. Esta técnica se basa en la fuerza generada por la inyección rápida de un gran volumen de solución fisiológica para aumentar la permeabilidad de las membranas celulares de órganos perfundidos y por lo tanto introducir ADN en las células. Una de las principales ventajas de DAG es la capacidad de introducir transgenes en células de mamífero utilizando el ADN plásmido desnudo (pADN). La introducción de un gen exógeno utilizando un plásmido que es mínimamente laborioso, altamente eficiente y, en contra de los transportistas virales, muy segura. DAG se utilizó inicialmente para suministrar genes en ratones, que se utiliza ahora para ofrecer una amplia gama de sustancias, incluyendo oligonucleótidos, cromosomas artificiales, ARN, proteínas y pequeñas moléculas en ratones, ratasy, en un grado limitado, otros animales. Este protocolo describe HGD en ratones y se centra en tres aspectos claves del método que son fundamentales para realizar el procedimiento con éxito: la correcta inserción de la aguja en la vena, el volumen de inyección y la velocidad de entrega. Se dan ejemplos para mostrar la aplicación de este método para la expresión transitoria de dos genes que codifican proteínas secretadas, primates específica, la apolipoproteína LI (apoL-I) y la proteína relacionada con haptoglobina-(HPR).
Introduction
Desde su primera descripción por Liu et al. Y Zhang et al., La entrega de genes hidrodinámico (DAG) se ha convertido en una herramienta muy valiosa para el estudio de la función génica en sistemas de modelos de roedores 1, 2. La técnica consiste en la inyección rápida (5-7 segundos) de un volumen grande (8-12% de peso corporal) de solución en la vena de la cola de los ratones para facilitar la captación de ADN plásmido por las células de órganos diana 1, 2. Estas condiciones conducen a robusto expresión génica en el hígado y menos la expresión de genes en el riñón, bazo, pulmón y corazón.
La inyección de 10 mg plásmido pCMV-lacZ puede transfectar tanto como 40% de los hepatocitos, lo que hace HGD el método más eficiente, no viral, pt la entrega de genes in vivo hasta la fecha 1. A diferencia de los portadores virales, pDNA es fácil de preparar, no provocar una respuesta inmune en el huésped roedor 3 y que no constituya un riesgo para la salud mediante la recombinación con el extremovirus exógenas. Además, ya que las moléculas de ADN entregadas por DAG no necesitan envasado, este método es adecuado para la entrega de cromosomas artificiales bacterianos (BAC) tan grandes como 150 kb 4. Otros tipos de moléculas que han sido entregados por un método hidrodinámico incluyen ARN 5-10, morfolinos 11, proteínas de 12, 13 y otras moléculas pequeñas 12, 14. Las ventajas y desventajas de DAG con respecto a otros métodos de entrega se han discutido en las excelentes críticas en la literatura 15-20 y un número de autores han proporcionado una descripción detallada del procedimiento 21-23.
La introducción de transgenes en ratones por DAG es seguro y eficaz 1-3, 24 y el método se ha usado en ratas con éxito comparable 25. Con algunas modificaciones, los experimentos de prueba de concepto se han llevado a cabo en pollos 26, rablos bits 27 y 28 cerdos, aunque, la aplicación in vivo de esta técnica en animales más grandes sigue siendo un reto. Cuando se utiliza este método, otra limitación común es que muchos de los vectores de expresión de mamíferos disponibles carecen de los componentes para lograr una, persistente alto nivel de la expresión génica. El uso de un plásmido, la expresión génica pCMV-Luc en los órganos diana es evidente tan pronto como diez minutos después de la DAG, sin embargo, el nivel de expresión inicial, alta cae bruscamente en la primera semana después de la inyección 1. Expresión de los transgenes a largo plazo es posible, dependiendo del promotor y el intrón utilizado en el diseño de plásmido 3, 24 inyecciones sin embargo, el mantenimiento de la expresión génica de alto nivel a menudo requiere repetidas. Por esta razón, HGD puede ser menos adecuado para estudiar enfermedades crónicas que son un resultado de la exposición a largo plazo a las proteínas perjudiciales o productos de la proteína. Con estas limitaciones, DAG es una herramienta excepcionalmente poderosa para el estudio de la popapel potencial de un gen y el efecto de que los mutantes in vivo, así como los efectos terapéuticos y la regulación de proteínas y para el establecimiento de modelos animales de la enfermedad (para una revisión, ver 15). Por ejemplo, HGD puede utilizarse para asignar la función a los dominios y aminoácidos de las proteínas mediante la introducción de forma individual diferentes construcciones de genes en ratones que tienen los respectivos genes noqueado. Además, esta técnica puede ser utilizado en cualquier cepa de ratón.
Este protocolo describe HGD en ratones con un enfoque en los aspectos técnicos necesarios para lograr la transfección exitosa: la inserción correcta de la aguja en la vena, el volumen de inyección y la velocidad de entrega. La aplicación de este método se demostró en un modelo de ratón de la tripanosomiasis africana, una enfermedad mortal de los humanos y el ganado 29 de 30. Aunque varias especies de tripanosomas causan enfermedades en el ganado, la mayoría no puede causar enfermedad en seres humanos debido a los complejos inmunes innatas en blood llamadas factores líticos tripanosoma (Tlfs) 29, 31, 32. Estos, lipoproteínas de alta densidad de formación de poros (HDL) contienen dos proteínas únicas, primates específica:. HPR, el ligando, lo que facilita la absorción de Tlfs en tripanosomas, y apoL-I, el componente lítico 31, 33-38 Trypanosoma brucei rhodesiense es capaz de infectar a los humanos debido a la expresión de una proteína asociada a la resistencia sérica (SRA) que se une y neutraliza humana apoL-I 34, 39. Baboon TLF no es neutralizada por SRA por su divergente proteína apoL-I 40. Como se informó anteriormente, el uso de un vector de expresión de mamíferos (pRG977), la expresión transgénica de componentes TLF babuino en ratones confiere protección contra los tripanosomas humanos infecciosa 40. Los datos representativos presentados aquí demuestran cómo se puede aplicar la entrega de genes hidrodinámico para estudiar los efectos terapéuticos de una proteína.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cuando se realiza correctamente, DAG es un medio muy seguro y eficaz de la prestación de los transgenes. Los pasos críticos para el éxito de DAG son: 1) la entrega de la cantidad correcta de ADN en un gran volumen de vehículo de solución salina 2) en la vena de la cola del ratón 3) en menos de 8 segundos.
Aunque el proceso de inyección en sí requiere sin duda alguna destreza manual, el éxito de este seis segundos procedimiento a menudo se encuentra en una cuidadosa preparación del …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Damos las gracias a Liu Xia (Regeneron Pharmaceuticals) para inicialmente nos enseña la técnica de DAG y el Dr. Russell Thomson (Albert Einstein College of Medicine) por su orientación continua en diversos aspectos de la tecnología. Este trabajo fue financiado por el Hunter College, CUNY puesta en marcha de fondos y adjudicación NSF Pan IOS-1249166. Damos las gracias a la subvención de apoyo NYULMC Histopatología Core NYUCI Center, NIH / NCI 5 P30CA16087-31 para la histología en el hígado del ratón.
Materials
| Alcohol Prep Wipe | Webcol | 6818 | |
| AST kit, Amplite Colorimetric | AAT Bioquest | 13801 | |
| Conical Tube, 50 ml | BD Falcon | 352070 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| KimWipes | KIMTECH | 34120 | |
| Mouse Tail Illuminator | Braintree Scientific | MTI RST | Or equivalent |
| Needle, 20 Gx 1 (0.9mmx25mm) | BD | 305175 | |
| Needle, 27 Gx 1/2 (0.9mmx25mm) | BD | 305109 | |
| pRG977 (mammalian expression vector) | Regeneron Pharmaceuticals | Material Transfer Agreement required | |
| Sodium Chloride, 0.9% INJ USP 10 ml, Hospira | Fisher | NC9054335 | |
| Syringe, 3ml, Luer-Lok Tip | BD | 309657 | Luer Lock necessary to withstand pressure from HGD |
Referências
- Liu, F., Song, Y., Liu, D. Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA. Gene Ther. 6, 1258-1266 (1999).
- Zhang, G., Budker, V., Wolff, J. A. High levels of foreign gene expression in hepatocytes after tail vein injections of naked plasmid DNA. Hum Gene Ther. 10, 1735-1737 (1999).
- Miao, C. H., Thompson, A. R., Loeb, K., Ye, X. Long-term and therapeutic-level hepatic gene expression of human factor IX after naked plasmid transfer in vivo. Mol Ther. 3, 947-957 (2001).
- Magin-Lachmann, C., et al. In vitro and in vivo delivery of intact BAC DNA — comparison of different methods. J Gene Med. 6, 195-209 (2004).
- Chang, J., Sigal, L. J., Lerro, A., Taylor, J. Replication of the human hepatitis delta virus genome Is initiated in mouse hepatocytes following intravenous injection of naked DNA or RNA sequences. J Virol. 75, 3469-3473 (2001).
- Giladi, H., et al. Small interfering RNA inhibits hepatitis B virus replication in mice. Mol Ther. 8, 769-776 (2003).
- Kobayashi, N., et al. Vector-based in vivo RNA interference: dose- and time-dependent suppression of transgene expression. J Pharmacol Exp Ther. 308, 688-693 (2004).
- Layzer, J. M., et al. In vivo activity of nuclease-resistant siRNAs. Rna. 10, 766-771 (2004).
- McCaffrey, A. P., et al. RNA interference in adult mice. Nature. 418, 38-39 (2002).
- McCaffrey, A. P., et al. Determinants of hepatitis C translational initiation in vitro, in cultured cells and mice. Mol Ther. 5, 676-684 (2002).
- McCaffrey, A. P., Meuse, L., Karimi, M., Contag, C. H., Kay, M. A. A potent and specific morpholino antisense inhibitor of hepatitis C translation in mice. Hepatology. 38, 503-508 (2003).
- Zhang, G., et al. Hydroporation as the mechanism of hydrodynamic delivery. Gene Ther. 11, 675-682 (2004).
- Kobayashi, N., Kuramoto, T., Yamaoka, K., Hashida, M., Takakura, Y. Hepatic uptake and gene expression mechanisms following intravenous administration of plasmid DNA by conventional and hydrodynamics-based procedures. J Pharmacol Exp Ther. 297, 853-860 (2001).
- Kobayashi, N., Nishikawa, M., Hirata, K., Takakura, Y. Hydrodynamics-based procedure involves transient hyperpermeability in the hepatic cellular membrane: implication of a nonspecific process in efficient intracellular gene delivery. J Gene Med. 6, 584-592 (2004).
- Bonamassa, B., Hai, L., Liu, D. Hydrodynamic gene delivery and its applications in pharmaceutical research. Pharm Res. 28, 694-701 (2011).
- Al-Dosari, M. S., Gao, X. Nonviral gene delivery: principle, limitations, and recent progress. Aaps J. 11, 671-681 (2009).
- Gao, X., Kim, K. S., Liu, D. Nonviral gene delivery: what we know and what is next. Aaps J. 9, (2007).
- Herweijer, H., Wolff, J. A. Gene therapy progress and prospects: hydrodynamic gene delivery. Gene Ther. 14, 99-107 (2007).
- Kobayashi, N., Nishikawa, M., Takakura, Y. The hydrodynamics-based procedure for controlling the pharmacokinetics of gene medicines at whole body, organ and cellular levels. Adv Drug Deliv Rev. 57, 713-731 (2005).
- Al-Dosari, M. S., Knapp, J. E., Liu, D. Hydrodynamic delivery. Adv Genet. 54, 65-82 (2005).
- Bell, J. B., et al. Preferential delivery of the Sleeping Beauty transposon system to livers of mice by hydrodynamic injection. Nat Protoc. 2, 3153-3165 (2007).
- Osorio, F. G., de la Rosa, J., Freije, J. M. Luminescence-based in vivo monitoring of NF-kappaB activity through a gene delivery approach. Cell Commun Signal. 11, (2013).
- Knapp, J. E., Liu, D. Hydrodynamic delivery of DNA. Methods Mol Biol. 245, 245-250 (2004).
- Yang, J., Chen, S., Huang, L., Michalopoulos, G. K., Liu, Y. Sustained expression of naked plasmid DNA encoding hepatocyte growth factor in mice promotes liver and overall body growth. Hepatology. 33, 848-859 (2001).
- Maruyama, H., et al. High-level expression of naked DNA delivered to rat liver via tail vein injection. J Gene Med. 4, 333-341 (2002).
- Hen, G., et al. Expression of foreign genes in chicks by hydrodynamics-based naked plasmid transfer in vivo. Domestic animal endocrinology. 30, 135-143 (2006).
- Eastman, S. J., et al. Development of catheter-based procedures for transducing the isolated rabbit liver with plasmid DNA. Hum Gene Ther. 13, 2065-2077 (2002).
- Yoshino, H., Hashizume, K., Kobayashi, E. Naked plasmid DNA transfer to the porcine liver using rapid injection with large volume. Gene Ther. 13, 1696-1702 (2006).
- Vanden Bossche, P. Some general aspects of the distribution and epidemiology of bovine trypanosomosis in southern Africa. Int J Parasitol. 31, 592-598 (2001).
- Fevre, E. M., Picozzi, K., Jannin, J., Welburn, S. C., Maudlin, I. Human African trypanosomiasis: Epidemiology and control. Adv Parasitol. 61, 167-221 (2006).
- Lugli, E. B., Pouliot, M., Portela Mdel, P., Loomis, M. R., Raper, J. Characterization of primate trypanosome lytic factors. Mol Biochem Parasitol. 138, 9-20 (2004).
- Pays, E., et al. The trypanolytic factor of human serum. Nat Rev Microbiol. 4, 477-486 (2006).
- Raper, J., Fung, R., Ghiso, J., Nussenzweig, V., Tomlinson, S. Characterization of a novel trypanosome lytic factor from human serum. Infect Immun. 67, 1910-1916 (1999).
- Vanhamme, L., et al. Apolipoprotein L-I is the trypanosome lytic factor of human serum. Nature. 422, 83-87 (2003).
- Nielsen, M. J., et al. Haptoglobin-related protein is a high-affinity hemoglobin-binding plasma protein. Blood. 108, 2846-2849 (2006).
- Molina-Portela Mdel, P., Lugli, P., Recio-Pinto, E., Raper, J. Trypanosome lytic factor, a subclass of high-density lipoprotein, forms cation-selective pores in membranes. Mol Biochem Parasitol. 144, 218-226 (2005).
- Perez-Morga, D., et al. Apolipoprotein L-I promotes trypanosome lysis by forming pores in lysosomal membranes. Science. 309, 469-472 (2005).
- Molina-Portela, M. P., Samanovic, M., Raper, J. Distinct roles of apolipoprotein components within the trypanosome lytic factor complex revealed in a novel transgenic mouse model. J Exp Med. 205, 1721-1728 (2008).
- Oli, M. W., Cotlin, L. F., Shiflett, A. M., Hajduk, S. L. Serum resistance-associated protein blocks lysosomal targeting of trypanosome lytic factor in Trypanosoma brucei. Eukaryot Cell. 5, 132-139 (2006).
- Thomson, R., Molina-Portela, P., Mott, H., Carrington, M., Raper, J. Hydrodynamic gene delivery of baboon trypanosome lytic factor eliminates both animal and human-infective African trypanosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 19509-19514 (2009).
- Genovese, G., et al. Association of trypanolytic ApoL1 variants with kidney disease in African Americans. Science. 329, 841-845 (2010).
- Tzur, S., et al. Missense mutations in the APOL1 gene are highly associated with end stage kidney disease risk previously attributed to the MYH9 gene. Hum Genet. 128, 345-350 (2010).
- Suda, T., Gao, X., Stolz, D. B., Liu, D. Structural impact of hydrodynamic injection on mouse liver. Gene Ther. 14, 129-137 (2007).
