Transient Expression av proteiner från Hydrodynamisk Gene Delivery hos möss

Summary

In vivo-transfektion av naket DNA av hydrodynamiskt genleverans införs gener in i vävnaden av ett djur med minimal inflammatorisk reaktion. Tillräckliga mängder av genprodukt genereras så att genfunktion och reglering samt protein struktur och funktion kan analyseras.

Abstract

Effektiv expression av transgener in vivo är av kritisk betydelse för att studera genfunktion och utveckla behandlingar för sjukdomar. Under de senaste åren har hydrodynamisk genleverans (HGD) dykt upp som en enkel, snabb, säker och effektiv metod för att leverera transgener i gnagare. Denna teknik är beroende av den kraft som genereras av en snabb injektion av en stor volym av fysiologisk lösning för att öka permeabiliteten av cellmembranen i perfunderade organ och därmed leverera DNA in i celler. En av de viktigaste fördelarna med höggradig dysplasi är möjligheten att införa transgener i däggdjursceller med hjälp av naket plasmid-DNA (pDNA). Introduktion av en exogen gen med användning av en plasmid som är minimalt mödosamt, mycket effektiv och, i motsats till virusbärare, anmärkningsvärt säker. HGD användes ursprungligen för att leverera gener i möss, är det nu används för att leverera ett brett spektrum av ämnen, inklusive oligonukleotider, artificiella kromosomer, RNA, proteiner och små molekyler i möss, råttoroch, i begränsad utsträckning, andra djur. Detta protokoll beskriver höggradig dysplasi hos möss och fokuserar på tre viktiga aspekter av den metod som är avgörande för att utföra proceduren framgångsrikt: korrekt insättning av nålen i venen, volymen av injektionen och den snabba leveransen. Exempel ges för att visa tillämpningen av denna metod för att övergående uttryck av två gener som kodar för utsöndrade, primat-specifika proteiner, apolipoprotein LI (APOL-I) och haptoglobin relaterat protein (HPR).

Introduction

Sedan den första beskrivningen av Liu et al. Och Zhang et al., Har hydrodynamisk genleverans (HGD) blivit ett ovärderligt verktyg för att studera geners funktion i gnagare modellsystem ^{1, 2.} Tekniken innebär att en snabb injektion (5-7 sek) av en stor volym (8-12% kroppsvikt) av lösning i svansvenen hos möss för att underlätta upptag av plasmid-DNA från cellerna av målorganen ^{1, 2.} Dessa förhållanden leder till stabil genexpression i levern och mindre genuttryck i njure, mjälte, lungor och hjärta.

Injektion av 10 ug pCMV-LacZ plasmiden kan transfektion av så mycket som 40% av leverceller, vilket gör HGD det mest effektiva, icke-virala, in vivo-gen leveransmetod hittills ^1. Till skillnad från virusbärare, är lätt att förbereda pDNA, inte framkalla ett immunsvar i gnagare värd ³ och inte utgör en hälsorisk genom rekombination med slutetogenous virus. Dessutom, eftersom de DNA-molekyler som levereras av HGD inte behöver förpackningar, är denna metod lämplig för leverans av bakteriella artificiella kromosomer (BAC) är så stora som 150 kb ^4. Andra typer av molekyler som har levererats av en hydrodynamisk metod inkluderar RNA ^5-10, morpholinos ^11, proteiner ^{12, 13} och andra små molekyler ^{12, 14.} Fördelarna och nackdelarna med höggradig dysplasi under andra leveransmetoder har diskuterats i utmärkta recensioner i litteraturen ^15-20 och ett antal författare har gett en detaljerad beskrivning av förfarandet ^21-23.

Att införa transgener i möss med höggradig dysplasi är säker och effektiv ^{1-3, 24} och metoden har använts i råttor med jämförbar framgång ^25. Med vissa modifieringar, har proof-of-concept experiment genomförts i kycklingar ^26, rabbits ²⁷ och grisar ^28, även om den vivo ansökan om denna teknik i större djur är fortfarande en utmaning. Vid användning av denna metod, är en annan vanlig begränsning att många av de tillgängliga däggdjursexpressionsvektorer saknar de komponenter för att uppnå en ihållande, hög nivå av genuttryck. Med hjälp av en pCMV-Luc plasmid, genuttryck i målorganen är tydlig redan efter tio minuter efter höggradig dysplasi, men tappar den ursprungliga, höga uttrycksnivån kraftigt under den första veckan efter injektion ^1. Långsiktig transgen uttryck är möjliga beroende på promotorn och intron som används i plasmid konstruktion ^{3, 24} dock upprätthålla hög nivå genuttryck ofta kräver upprepade injektioner. Därför kan HGD vara mindre lämpligt att studera kroniska sjukdomar som är en följd av långvarig exponering för skadliga proteiner eller proteinprodukter. Med dessa begränsningar, är HGD ett ovanligt kraftfullt verktyg för att studera potial rollen av en gen och effekten av det mutanter in vivo, såväl som de terapeutiska effekterna och regleringen av proteiner och för att etablera djurmodeller av sjukdomen (för översikt, se ^15). Exempelvis kan HGD användas för att tilldela funktionen till domäner och aminosyrorna i proteiner genom att individuellt införa olika genkonstruktioner in i möss som har respektive gener slås ut. Vidare kan denna teknik användas i varje musstam.

Detta protokoll beskriver höggradig dysplasi i möss med fokus på de tekniska aspekter som är nödvändiga för att uppnå framgångsrik transfektion: nålens insättning i venen, injektionsvolym och snabb leverans. Tillämpningen av denna metod demonstreras i en musmodell av afrikansk trypanosomiasis, en dödlig sjukdom hos människor och boskap ^{29, 30.} Även om flera arter av trypanosomer orsakar sjukdom hos djur, de flesta kan inte orsaka sjukdom hos människor på grund av medfödda immunkomplex i b.Lood kallade trypanosominfekterade lytiska faktorer (TLFs) ^{29, 31, 32.} Dessa por-bildande, lipoproteiner med hög densitet (HDL) innehåller två unika, primat-specifika proteiner:. HPR, den ligand, vilket underlättar upptaget av TLFs in trypanosomer, och APOL-I, den lytiska komponent ^{31, 33-38} Trypanosoma brucei rhodesiense kan smitta människor på grund av uttryck av ett serum motstånd-associerat protein (SRA) som binder till och neutraliserar human APOL-I ^{34, 39.} Babian TLF neutraliseras inte av SRA på grund av dess divergerande APOL-I-protein ^40. Som tidigare rapporterats, med hjälp av en däggdjursexpressionsvektor (pRG977), transgent uttryck av babian TLF komponenter i möss ger skydd mot de mänskliga infektioner trypanosomer ^40. De representativa data som presenteras här visar hur hydrodynamiska gen leverans kan tillämpas för att studera de terapeutiska effekterna av ett protein.

Protocol

Alla experiment som beskrivs här har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén av Hunter College, City University i New York. 1. Framställning av endotoxinfritt plasmid-DNA Plocka en enda koloni av bakterier innehållande genen av intresse i en däggdjursexpressionsvektor från en nyligen streaked selektiv platta. Följ rekommendationerna i handboken för en kommersiellt tillgänglig endotoxin-fria plasmidrening kit för att odla och skörda bak…

Representative Results

Korrekt placering av nålen i svansvenen av musen (som visas i figur 1) är en förutsättning för att kunna ge en transgen av hydrodynamik-baserade transfektion. Ofta den mest utmanande delen av tekniken, däremot, är bibehållandet av nålen i svansvenen utan rörelse så att hela volymen av injektionen kan levereras inom 6-8 ar. Mindre fel under insprutningsprocessen kan leda till kraftigt minskade transfektion effektivitet och proteinuttryck. Därför är det absolut nödvändigt att övervaka fra…

Discussion

När de utförs på rätt sätt, är HGD ett anmärkningsvärt säker och effektiv sätt att transgen leverans. De kritiska stegen till lyckad HGD är: 1) att leverera rätt mängd DNA i en stor volym av saltlösning fordon 2) i svansvenen av musen 3) på mindre än 8 sekunder.

Även om processen med injektionen själv kräver onekligen en del fingerfärdighet, framgången för denna sex andra förfarandet ofta ligger i noggranna förberedelser av experimentet. Mängden pDNA nödvändigt fö…

Materials

Alcohol Prep Wipe	Webcol	6818
AST kit, Amplite Colorimetric	AAT Bioquest	13801
Conical Tube, 50 ml	BD Falcon	352070
EndoFree Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12362
KimWipes	KIMTECH	34120
Mouse Tail Illuminator	Braintree Scientific	MTI RST	Or equivalent
Needle, 20 Gx 1 (0.9mmx25mm)	BD	305175
Needle, 27 Gx 1/2 (0.9mmx25mm)	BD	305109
pRG977 (mammalian expression vector)	Regeneron Pharmaceuticals		Material Transfer Agreement required
Sodium Chloride, 0.9% INJ USP 10 ml, Hospira	Fisher	NC9054335
Syringe, 3ml, Luer-Lok Tip	BD	309657	Luer Lock necessary to withstand pressure from HGD