Een Engulfment Assay: Een protocol bij interacties tussen CNS Fagocyten en Neuronen Assess
Summary
Microglia vormen de bewoner immuuncellen van het centrale zenuwstelsel (CZS) met een hoge capaciteit te fagocyteren of overspoelen materiaal in hun extracellulaire omgeving. Hier wordt een breed toepasbare, betrouwbaar en zeer kwantitatieve assay voor het visualiseren en meten-gemedieerde microglia afblazen van synaptische componenten beschreven.
Abstract
Fagocytose is een proces waarbij een cel overspoelt materiaal (hele cel, delen van een cel, vuil, enz.) in de omringende extracellulaire omgeving en vervolgens verteert dit materiaal, meestal door lysosomale afbraak. Microglia vormen de bewoner immuuncellen van het centrale zenuwstelsel (CZS) die fagocytosefunctietesten is beschreven in een groot aantal aandoeningen van neurodegeneratieve ziekten (bijvoorbeeld beta-amyloid klaring bij de ziekte van Alzheimer) ontwikkeling van gezonde hersenen (bijv. synaptische snoeien) 1-6. Het volgende protocol is een engulfment test ontwikkeld om te visualiseren en te kwantificeren-microglia gemedieerde afblazen van presynaptische input in de ontwikkeling van de muis retinogeniculate systeem 7. Hoewel deze test werd gebruikt om microglia functie in dit verband beoordelen kan een gelijkaardige benadering worden gebruikt om andere fagocyten door de hersenen (bijvoorbeeld astrocyten) en de rest van het lichaam bepalen(Bijvoorbeeld perifere macrofagen) en andere contexten waarin synaptische remodeling optreedt (bijvoorbeeld hersenbeschadiging / ziekte).
Introduction
Synaptische circuits verbouwen tijdens de gehele levensduur van een dier. In de zich ontwikkelende hersenen, synapsen vormen boven en moet synaptische snoeien die de selectieve verwijdering van een subset van synapsen en het behoud en versterking van deze synapsen die overblijven 8-10 impliceert ondergaan. Dit proces is noodzakelijk om de precieze connectiviteit kenmerk van het volwassen zenuwstelsel bereiken. In de volwassen, kan synapsen ook plastic zijn, met name in het kader van leren en geheugen. De structurele correlaten van deze plasticiteit wordt gedacht aan het toevoegen en / of eliminatie van dendritische spines en presynaptische boutons 11-13 omvatten. Naast deze functies in de gezonde zenuwstelsel wordt synaptische remodelleren ook betrokken bij zenuwstelsel / letsels 12,14,15. Bijvoorbeeld, na dwarslaesie, gescheiden axonen moeten vervolgens verbouwen en vormen nieuwe synapsen tot functioneel herstel 16-19 te bereiken.
nt '> opkomst als een belangrijk aspect van synaptische plasticiteit is het proces van fagocytose of afblazen van synapsen bestemd voor het verwijderen 3,5,20. We toonden onlangs dit verschijnsel in het kader van synaptische snoeien in de gezonde, postnatale hersenen van muizen 7. Specifiek , microglia, de resident CNS immuuncellen en fagocyten, bleken presynaptische ingangen overspoelen tijdens een piekperiode en in een gebied van ontwikkelings-synaptische snoeien, de postnatale dorsale laterale nucleus geniculate (dLGN) van de thalamus. genetische of farmacologische blokkade van deze engulfment resulteerde in aanhoudende tekorten in synaptische connectiviteit.In dit protocol beschrijven we een betrouwbare en zeer kwantitatieve bepaling om fagocyt-gemedieerde afblazen van presynaptische inputs meten. Voor de toepassing van dit artikel, zal deze test in het kader van de ontwikkeling van retinogeniculate systeem, dat retinale ganglion cellen bevat (RGC) die woonachtig zijn in het netvlies worden gepresenteerd datprojecteren presynaptische input voor de dLGN (figuur 1A). Om te beginnen, een lysosomale afbraak-resistente anterograde labeling strategie worden beschreven, die wordt gebruikt om RGC-specifieke ingangen in de presynaptische dLGN (figuur 1) 7,21 visualiseren. Na deze beschrijving, een gedetailleerde methodologie voor beeldvorming en kwantitatief meten afblazen via confocale microscopie gecombineerd met 3-dimensionale (3D) oppervlaktevolume weergave worden gegeven. Deze methode is gebaseerd op vaste preparaat weefsel maar kan ook worden aangepast voor gebruik in levende weergavestudies. Belangrijk, terwijl de test is gevalideerd in het kader van de gezonde, postnatale retinogeniculate systeem kon dezelfde technieken op andere fagocyt-neuron interacties door de hersenen en tijdens ziekte en fagocyt functie in andere orgaansystemen beoordelen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Om fagocytose nauwkeurig moet overspoeld materiaal zodanig dat de onderzoeker kan visualiseren wanneer lysosomale degradatie opgetreden gelabeld. Bovendien is een hoge resolutie beeldvorming vereist, gevolgd door het gebruik van software die de onderzoeker in staat stelt het volume van de hele cel visualiseren en kwantificeren van de inhoud. In dit protocol beschrijven we een zeer betrouwbare en kwantitatieve werkwijze voor het meten fagocyt-gemedieerde afblazen met CTB geconjugeerd met Alexa kleurstoffen overspoeld mat…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Werk werd ondersteund door subsidies van de Smith Family Foundation (BS), Dana Foundation (BS), John Merck Scholars Program (BS), NINDS (RO1-NS-07100801, BS), NRSA (F32-NS-066698; DPS), Nancy Lurie Marks Foundation (DPS), NIH (P30-HD-18655; MRDDRC Imaging Core).
Materials
| Heat pad | Vet Equip, Inc. | 965500 | |
| Warm water source for heat pad | Kent Scientific | TP-700 | |
| Stereo microscope | DSC Optical | Zeiss Opmi -6 Surgical Microscope | |
| Sliding microtome with freezing stage | Leica | SM2010 R | |
| Microtome blade | Leica | 14021607100 | |
| Fluorescent dissecting microscope | Nikon | SMZ800 with Epi-fluorescence attachment | |
| Spinning disk confocal microscope | Perkin Elmer | UltraView Vox Spinning Disk Confocal | |
| 10 µl Hamilton gas tight syringes | Hamilton | 80030 | Use a different syringe for each color dye/tracer |
| Hamilton needles | Hamilton | 7803-05, specifications: blunt, 1.5" | |
| Alexa-conjugated cholera toxin β subunit (CTB) | Invitrogen | 488: C22841 | Reconstitute in sterile saline, 80 µl (488), 100 µl (594), 20 µl (647) |
| 594: C22842 | |||
| 647: C34778 | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | P4417-50TAB | |
| Neomycin and Polymyxin B Sulfates and Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment USP (antibiotic ointment) | Bausch & Lomb | 24208-780-55 | |
| 30.5 gauge needle | Becton Dickinson | 305106 | |
| Spring scissors | Roboz | RS-5630 | |
| Cotton-tipped applicator | Fisher | 23-400-125 | |
| Paraformaldeyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute 16%to 4% in PBS. Paraformaldehye is toxic, use in a fume hood and wear personal protective equipment. |
| Dissection tools – scissors, forceps, spatula | Small scissors: Fine Science Tools | Small scissors:14370-22 | |
| Large scissors: Roboz | Large scissors: RS-6820 | ||
| #55 forceps: Fine Science Tools | #55 forceps: 11255-20 | ||
| Spatula: Ted Pella, Inc. | Spatula: 13504 | ||
| Sucrose | Sigma | S8501-5KG | Make 30% sucrose in PBS (weight/vol) |
| OCT Compound | VWR | 25608-930 | |
| Weigh boat | USA Scientific | 2347-1426 | |
| 24-well plates | BD Biosciences | 353047 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S6566-500G | Make 0.2 M sodium phosphate monobasic (PB-A) in ddH20 and 0.2 M sodium phosphate dibasic (PB-B) in ddH20. To make 0.1 M PB, combine 19 ml PB-A and 81 ml PB-B, fill to 200 ml with ddH20 |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S5136-500G | |
| Coverslips, 22 X 50 mm, No. 1.5 | VWR | 48393 194 | |
| Charged microscope slide | VWR | 48311-703 | |
| Vectasheild | Vector Laboratories | H-1200 |
Referências
- Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses. Annu Rev Immunol. 27, 119-145 (2009).
- Aguzzi, A., et al. Microglia: scapegoat, saboteur, or something else. Science. 339 (6116), 156-161 (2013).
- Tremblay, M. E., et al. The role of microglia in the healthy brain. J Neurosci. 31 (45), 16064-16069 (2011).
- Hanisch, U. K., Kettenmann, H. Microglia: active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain. Nat. Neurosci. 10 (11), 1387-1394 (2007).
- Sierra, A., et al. Janus-faced microglia: beneficial and detrimental consequences of microglial phagocytosis. Front Cell Neurosci. 7, (2013).
- Dheen, S. T., et al. Microglial activation and its implications in the brain diseases. Curr Med Chem. 14 (11), 1189-1197 (2007).
- Schafer, D. P., et al. Microglia sculpt postnatal neural circuits in an activity and complement-dependent manner. Neuron. 74 (4), 691-705 (2012).
- Katz, L., Shatz, C. Synaptic activity and the constuction of cortical circuits. Science. 274 (5290), 1133-1138 (1996).
- Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Development of the vertebrate neuromuscular junction. Annu Rev Neurosci. 22, 389-442 (1999).
- Hua, J. Y., Smith, S. J. Neural activity and the dynamics of central nervous system development. Nat Neurosci. 7 (4), 327-332 (2004).
- Holtmaat, A., Svoboda, K. Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain. Nat Rev Neurosci. 10 (9), 647-658 (2009).
- Butz, M., et al. Activity-dependent structural plasticity. Brain Res Rev. 60 (2), 287-305 (2009).
- Bruel-Jungerman, E., et al. Brain plasticity mechanisms and memory: a party of four. Neuroscientist. 13 (5), 492-505 (2007).
- Schafer, D. P., Stevens, B. Synapse elimination during development and disease: immune molecules take centre stage. Biochem Soc Trans. 38 (2), 476-481 (2010).
- Alexander, A., et al. The complement system: an unexpected role in synaptic pruning during development and disease. Annu Rev Neurosci. 35, 369-389 (2012).
- Brown, A., Weaver, L. C. The dark side of neuroplasticity. Exp Neurol. 235 (1), 133-141 (2012).
- Navarro, X. Chapter 27: Neural plasticity after nerve injury and regeneration. Int Rev Neurobiol. 87, 483-505 (2009).
- Tan, A. M., Waxman, S. G. Spinal cord injury, dendritic spine remodeling, and spinal memory mechanisms. Exp Neurol. 235 (1), 142-151 (2012).
- Wolpaw, J. R., Tennissen, A. M. Activity-dependent spinal cord plasticity in health and disease. Annu Rev Neurosci. 24, 807-843 (2001).
- Schafer, D. P., et al. The "quad-partite" synapse: Microglia-synapse interactions in the developing and mature CNS. Glia. 61 (1), 24-36 (2013).
- Mukhopadhyay, S., et al. Manganese-induced trafficking and turnover of the cis-Golgi glycoprotein GPP130. Mol Biol Cell. 21 (7), 1282-1292 (2010).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol Cell Biol. 20, 4106-4114 (2000).
- Knobloch, M., Mansuy, I. M. Dendritic spine loss and synaptic alterations in Alzheimer’s disease. Mol Neurobiol. 37 (1), 73-82 (2008).
- Masliah, E., et al. Synaptic remodeling during aging and in Alzheimer’s disease. J Alzheimers Dis. 9 (3 Suppl), 91-99 (2006).
- Yoshiyama, Y., et al. Synapse loss and microglial activation precede tangles in a P301S tauopathy mouse model. Neuron. 53 (3), 337-351 (1016).
- Milnerwood, A. J., Raymond, L. A. Early synaptic pathophysiology in neurodegeneration: insights from Huntington’s disease. Trends Neurosci. 33 (11), 513-523 (2010).
- Noda, M., Suzumura, A. Sweepers in the CNS: Microglial Migration and Phagocytosis in the Alzheimer Disease Pathogenesis. Int J Alzheimers Dis. , (2012).
- Rotshenker, S. Microglia and macrophage activation and the regulation of complement-receptor-3 (CR3/MAC-1)-mediated myelin phagocytosis in injury and disease. J Mol Neurosci. 21 (1), 65-72 (2003).
- Smith, M. E. Phagocytosis of myelin in demyelinative disease: a review. Neurochem Res. 24 (2), 261-268 (1999).
