Schaalbare High Throughput Selectie Van faagweergegeven Synthetische Antibody Bibliotheken
Summary
Een werkwijze wordt beschreven visuele begeleiding voor het uitvoeren schaalbare, high throughput selecties van faagweergegeven combinatoriële synthetische antilichaam bibliotheken tegen honderden antigenen tegelijkertijd. Met behulp van deze parallelle aanpak, hebben we geïsoleerd antilichaam fragmenten die een hoge affiniteit en specificiteit vertonen voor diverse antigenen die functioneel in standaard immunoassays zijn.
Abstract
De vraag naar antilichamen die de behoeften van zowel fundamenteel en klinisch onderzoek toepassingen te vervullen is hoog en zal drastisch toenemen in de toekomst. Het is echter duidelijk dat de traditionele monoklonaal technologieën niet alleen aan deze taak. Dit heeft geleid tot de ontwikkeling van alternatieve methoden om de vraag naar kwalitatief hoogwaardige en duurzame affiniteitsreagentia alle toegankelijke elementen van het proteoom voldoen. Met dit doel hebben high throughput methoden voor het uitvoeren van selecties uit faagweergegeven synthetische antilichaam bibliotheken werden ontwikkeld voor toepassingen in uiteenlopende antigenen en geoptimaliseerd voor snelle productie en succes. Hierin wordt een protocol in detail beschreven dat illustreert met video demonstratie van de parallelle selectie van Fab-faag klonen uit een hoge diversiteit bibliotheken tegen honderden doelen met behulp van een handleiding 96 kanaals vloeibare handler of geautomatiseerde robotica systeem. Met dit protocol kan een enkele gebruiker honderden antigenen genererenselecteer antilichamen om hen parallel en bevestig antilichaambinding binnen 6-8 weken. Gemarkeerd zijn: i) een levensvatbare antigeen formaat, ii) voorselectie antigen karakterisering, iii) kritische stappen die de selectie van specifieke en hoge affiniteit klonen beïnvloeden, en iv) vormen van toezicht selectie doeltreffendheid en jonge antilichaam kloon karakterisatie. Met deze benadering hebben we synthetische antilichaamfragmenten (Fab) verkregen vele doelwitten zoals single-pass membraanreceptoren, gesecreteerd eiwit hormonen en meerdere domeinen intracellulaire eiwitten. Deze fragmenten worden gemakkelijk omgezet in full-length antilichamen en gevalideerd hoge affiniteit en specificiteit vertonen. Verder hebben zij aangetoond functioneel in diverse standaard immunoassays zoals Western blotting, ELISA, cellulaire immunofluorescentie, immunoprecipitatie en aanverwante assays. Deze methodologie zal antilichaam ontdekking te versnellen en uiteindelijk terug te brengen ons dichter bij het realiseren van het doel of opwekking van duurzame, hoogwaardige antilichamen tegen het proteoom.
Introduction
Met het begin van de post-genoom tijdperk, de beschikbaarheid van hoogwaardige bindingreagentia te karakteriseren en moduleren eiwitten is essentieel voor nieuwe onderzoeks- en therapeutische mogelijkheden openen. Antilichamen blijven van cruciaal belang voor zowel de academische en industriële onderzoekers als fundamenteel onderzoek en diagnose-instrumenten en mogelijke therapieën te zijn. Niet verrassend, is er sprake van een indrukwekkende groei van het contract antilichaam-ontwikkeling bedrijven, waarvan de meeste vertrouwen op conventionele hybridoma- technologieën om aangepaste antilichamen te genereren. Niettemin, in vitro selectie met behulp van faagweergegeven antilichaam bibliotheken wordt een krachtig alternatief technologie die unieke voordelen en het succes waar de conventionele technologieën beperkingen 1, 2 kan zien kan bieden.
In het licht van de aanzienlijke vraag naar kwalitatief hoogwaardige antistoffen als research tools, twee primaire uitdagingen voor het opwekken van hernieuwbare antilichamen 1) selectie throughput en 2) antigeen availability. Een aantal groepen zijn nu beschreven in vitro selectie pijpleidingen die gericht zijn op het verhogen van de doorvoer en de mate van identificatie antilichaam. Deze beschrijvingen detail van een verscheidenheid van levensvatbare benaderingen die onder andere het selecteren van een van beide full-length richt 3,4, of structureel verwante domeinen 5,6,7, met op de kraal gebaseerd 6,8 of -plaat-gebaseerde 3,4 antigen immobilisatie regelingen. Bovendien heeft de groeiende interesse gen synthesetechnologieën 9 systematisch antigeen generatie gemaakt, bijzonder geïsoleerde domeinen redelijk kosteneffectief en kan mogelijk de moeilijkheid om voldoende hoeveelheden gezuiverd, full-length antigeen verlichten. Door de twee technologieën samen werd een zelfstandige en schaalbare antigen genereren en antilichaam selectie pijpleiding ingericht, dat parallel isolatie van antilichamen voor grote reeksen uitgedrukt antigeen domeinen mogelijk wordt en de ontwikkeling van reagentia voor cha vergemakkelijkenracterizing hele klassen van structureel of functioneel verwante eiwitten.
Tegen dit doel is een geïntegreerde pijpleiding die paren in silico identificatie van expressie antigen domeinen gensynthese, high-throughput bacteriële expressie van antigenen en schaalbare faagweergegeven antilichaam selecties ontwikkeld. Deze pijpleiding vereist slechts basisinfrastructuur beschikbaar voor de meeste life science laboratoria (waaronder antilichaam bibliotheken die steeds beschikbaar via licentie of inzake overdracht van materiaal zijn), maar is ook vatbaar voor automatisering voor gebruik op industriële schaal. Met dit protocol is het mogelijk om honderden affiniteit gelabeld antigen domeinen genereren en routinematig isoleren zeer specifieke antilichaamfragmenten veel van deze antigenen.
Faag display technologie toont aangetoond compatibiliteit met een breed scala van recombinant affiniteitsreagens formaten zoals Fab, scFv, Fv en autonome domeinen en eengroeiend aantal kleine 'alternatieve frameworks' (ontworpen ankyrin repeat eiwitten (DARPINS), fibronectine (Fn), lipocaline domeinen en meer 10). Discussie beperkt in dit voorbeeld voor de isolatie van Fab antilichaamfragmenten, hoewel wordt aangenomen deze werkwijzen kunnen worden aangepast aan andere soorten bibliotheken. Met deze technologie Fabs met lage nanomolaire affiniteit voor kleine, gelabeld eiwit domeinen waaronder transcriptie factor domeinen, SH2-domeinen, RNA-bindende eiwitten en anderen succesvol is, waarvan vele binden eiwit van volledige lengte en zijn functioneel in immunoassays zoals immunofluorescentie , immunoprecipitatie en immunohistochemie. Belangrijk recombinante bindende klonen volledig verlengd en kan opnieuw gegenereerd uit expressieconstructen via bacteriële productie aanbieden meer consistentie, reproduceerbaarheid en kosteneffectiviteit, waardoor de kosten van strenge kloon validatie rechtvaardigen.
In dit protocol en bijbehorende video, basismethoden voor antilichaam selectie uit faagweergegeven bibliotheken met behulp van geïmmobiliseerde antigeen domeinen worden aangetoond. Deze specifieke werkwijze maakt GST gemerkt eiwitdomeinen geïmmobiliseerd door passieve adsorptie in microwell platen, alhoewel andere labels 11,12,13 en selectie formats 13,14,2 zijn ook met succes toegepast. Kritische overwegingen voor de opzet en uitvoering van selecties met parallelle monitoring van selectie parameters gericht op het identificeren en isoleren van specifiek verrijkte klonale antilichamen voor validatie zijn gedetailleerd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bij het uitvoeren van in vitro antilichaam selecties, de twee belangrijkste determinanten van selectie succesvol zijn 1) het isoleren van goed gevouwen antigene doelen voor het selecteren op en 2) de beschikbaarheid van een hoge functionele diversiteit antilichaambibliotheek. In veel gevallen kan de beschikbaarheid van voldoende hoeveelheden goed gevouwen, full-length eiwit beperkend. Een benadering voor het overwinnen van deze beperking is om domeinen geïdentificeerd van bioinformatica analyse 22</…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij willen graag de NIH Gemeenschappelijk Fonds erkennen – Eiwit invangreagentia Programma voor de financiering van de ontwikkeling van het recombinant antilichaam Network antilichaam selectie en karakterisering pijplijn en de Canadese Stichting voor Innovatie voor financiering bij de aankoop van de robot selectie platform.
Materials
| MATERIALS | |||
| Name | Company | Catalog Number | |
| New Brunswick Innova44 stackable incubator shaker | Eppendorf | M1282-0004 | |
| Liquidator 96 channel manual benchtop pipetting system | Anachem Ltd | LIQ-96-200 | |
| Microplate shaker | VWR | 12620-926 | |
| ThermoScientific Sorvall ST-40 benchtop centrifuge | Thermo Product | 75004525 | |
| ELx405 Select Deep Well Microplate Washer | Biotek | ELX405USD | |
| Custom High Throughput Automated Phage Selection Robot | S&P Robotics | ||
| Plastic conical Falcon tube: 50 mL | VWR | 21008-178 | |
| Plastic conical Falcon tube: 15 mL | VWR | 89039-668 | |
| Axygen 1.7 mL microcentrifuge tubes | Corning | MCT-175-L-C | |
| 96-well/384-well Maxisorp plate | Sigma | M9410-1CS | |
| Corning 96-well V-bottom deep-well block | Corning | 3960 | |
| Axygen Mini-tube 96-well sterile microplate blue box | Corning | AXY-MTS-06-C-R-S | |
| Breathable adhesive plate sealing film | VWR | 60941-084 | |
| REAGENTS | |||
| Name | Company | Catalog Number | |
| polyethylene glycol | Bioshop | PEG800.1 | |
| yeast extract | Bioshop | YEX401.1 | |
| bio-tryptone | Bioshop | TRP402.1 | |
| N-Z amine | Sigma | C7290 | |
| glucose | Sigma | G8270-1KG | |
| lactose | Bioshop | LAC234 | |
| glycerol | Bioshop | GLY001.500 | |
| carbenicillin | Bioshop | CAR544.10 | |
| kanamycin | Bioshop | KAN201.25 | |
| tetracycline | Bioshop | TET701.25 | |
| Tween 20 | Bioshop | TWN510.500 | |
| monobasic potassium phophate | Bioshop | PPM302.1 | |
| dibasic sodium phosphate | Anachemia | 84486-440 | |
| sodium chloride | Bioshop | SOD001.10 | |
| potassium chloride | Bioshop | POC308.1 | |
| calcium chloride | Bioshop | CCL302.500 | |
| magnesium sulphate | EMD | MX0070-1 | |
| magnesium chloride | Bioshop | MAG510.500 | |
| NH4Cl | Amresco | 0621-1KG | |
| Na2SO4 | Bioshop | SOS513.500 | |
| agar | Bioshop | AGR001.500 | |
| SybrSafe DNA gel stain | Invitrogen | S33102 | |
| phosphoric acid | Acros Organics | 201140010 | |
| lysozyme | Bioshop | LYS702.25 | |
| benzonase | Novagen | 71205 | |
| Triton X-100 | Bioshop | TRX506.500 | |
| protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 11 836 170 001 | |
| Ni-NTA resin | Qiagen | 1018240 | |
| 1000x helper phage (M13K07) stock (1013 phage per mL) | NEB | N0315S | |
| HRP conjugated M13-specific antibody (anti-M13-HRP). | GE Healthcare | 27-9241-01 | |
| TMB substrate: mix equal volumes of TMB and H2O2 peroxidase substrate | KPL | 50-76-00 | |
| dNTPs | Biobasic | DD0056 | |
| Taq polymerase | Genscript | E00007 | |
| Exonuclease | GE Healthcare | EZ0073X-EZ | |
| Shrimp alkaline phosphatase | GE Healthcare | E70092Z-EZ | |
Referências
- Winter, G., Milstein, C. Man-made antibodies. Nature. 349, 293-299 (1991).
- Miersch, S., Sidhu, S. S. Synthetic antibodies: concepts, potential and practical considerations. Methods. 57, 486-498 (2012).
- Schofield, D. J., et al. Application of phage display to high throughput antibody generation and characterization. Genome Biol. 8, R254 (2007).
- Hust, M., et al. A human scFv antibody generation pipeline for proteome research. J. Biotechnol. 152, 159-170 (2011).
- Colwill, K., Graslund, S. A roadmap to generate renewable protein binders to the human proteome. Nat. Methods. 8, 551-558 (2011).
- Mersmann, M., et al. Towards proteome scale antibody selections using phage display. Nat. Biotechnol. 27, 118-128 (2010).
- Pershad, K., et al. Generating a panel of highly specific antibodies to 20 human SH2 domains by phage display. Protein Eng. Des. Sel. 23, 279-288 (2010).
- Turunen, L., Takkinen, K., Soderlund, H., Pulli, T. Automated panning and screening procedure on microplates for antibody generation from phage display libraries. J Biomol. Screen. 14, 282-293 (2009).
- Hughes, R. A., Miklos, A. E., Ellington, A. D. Gene synthesis: methods and applications. Methods Enzymol. 498, 277-309 (2011).
- Boersma, Y. L., Pluckthun, A. DARPins and other repeat protein scaffolds: advances in engineering and applications. 22, 849-857 (2011).
- Terpe, K. Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl. Microbiol. Biotechnol. 60, 523-533 (2003).
- Lichty, J. J., Malecki, J. L., Agnew, H. D., Michelson-Horowitz, D. J., Tan, S. Comparison of affinity tags for protein purification. Protein Expr. Purif. 41, 98-105 (2005).
- Fellouse, F. A., et al. High-throughput generation of synthetic antibodies from highly functional minimalist phage-displayed libraries. J. Mol. Biol. 373, 924-940 (2007).
- Paduch, M., et al. Generating conformation-specific synthetic antibodies to trap proteins in selected functional states. Methods. 60, 3-14 (2013).
- Studier, F. W. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Protein Expr. Purif. 41, 207-234 (2005).
- Huang, H., Sidhu, S. S. Studying binding specificities of peptide recognition modules by high-throughput phage display selections. Methods Mol. Biol. 781, 87-97 (2011).
- McLaughlin, M. E., Sidhu, S. S. Engineering and analysis of peptide-recognition domain specificities by phage display and deep Sequencing. Methods Enzymol. 523, 327-349 (2013).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
- den Engelsman, J., et al. Strategies for the assessment of protein aggregates in pharmaceutical biotech product development. Pharm. Res. 28, 920-933 (2011).
- Lavinder, J. J., Hari, S. B., Sullivan, B. J., Magliery, T. J. High-throughput thermal scanning: a general, rapid dye-binding thermal shift screen for protein engineering. J. Am. Chem. Soc. 131, 3794-3795 (2009).
- Fellouse, F. A., Sidhu, S. S., Howard, G. C., MR, K. a. s. e. r. . Making antibodies in bacteria. in Making and Using Antibodies: A Practical Handbook. , 151-172 (2013).
- Acton, T. B., et al. Preparation of protein samples for NMR structure, function, and small-molecule screening studies. Methods in Enzymology. 483, 23-47 (2011).
- Mahon, C. M., et al. Comprehensive interrogation of a minimalist synthetic CDR-H3 library and its ability to generate antibodies with therapeutic potential. J. Mol. Biol. 425, 1712-1730 (2013).
- Persson, H., et al. CDR-H3 diversity is not required for antigen recognition by synthetic antibodies. J. Mol. Biol. 425, 803-811 (2013).
- Bradbury, A. R., Sidhu, S., Dubel, S., McCafferty, J. Beyond natural antibodies: the power of in vitro display technologies. Nat. Biotechnol. 29, 245-254 (2011).
