फेज-प्रदर्शित सिंथेटिक एंटीबॉडी पुस्तकालयों से स्केलेबल उच्च Throughput चुनाव
Summary
एक विधि एक साथ एंटीजन के सैकड़ों के खिलाफ फेज-प्रदर्शित मिश्रित सिंथेटिक एंटीबॉडी पुस्तकालयों से स्केलेबल, उच्च throughput चयन के संचालन के लिए दृश्य संगत के साथ वर्णित है। इस समानांतर दृष्टिकोण का प्रयोग, हम मानक immunoassays में कार्य कर रहे हैं कि विविध एंटीजन के लिए उच्च आत्मीयता और विशिष्टता है कि प्रदर्शन एंटीबॉडी टुकड़े अलग-थलग पड़ गए हैं।
Abstract
दोनों बुनियादी और नैदानिक अनुसंधान अनुप्रयोगों की आवश्यकताओं को पूरा करने कि एंटीबॉडी के लिए मांग अधिक है और नाटकीय रूप से भविष्य में वृद्धि होगी। हालांकि, यह पारंपरिक मोनोक्लोनल टेक्नोलॉजीज इस कार्य को करने के लिए ऊपर अकेले नहीं हैं कि स्पष्ट है। इस proteome के सभी सुलभ तत्वों के लिए उच्च गुणवत्ता और अक्षय आत्मीयता अभिकर्मकों के लिए मांग को पूरा करने के लिए वैकल्पिक तरीकों का विकास करने के लिए प्रेरित किया है। यह अंत की ओर है, फेज-प्रदर्शित सिंथेटिक एंटीबॉडी पुस्तकालयों से चयन के संचालन के लिए उच्च तरीकों विविध एंटीजन से जुड़े अनुप्रयोगों के लिए तैयार किया गया है और तेजी से throughput और सफलता के लिए अनुकूलित। इस के साथ साथ, एक प्रोटोकॉल वीडियो प्रदर्शन के साथ एक मैनुअल 96 चैनल तरल हैंडलर या स्वचालित रोबोटिक्स प्रणाली का उपयोग कर लक्ष्य के सैकड़ों के खिलाफ उच्च विविधता पुस्तकालयों से फैब-फेज क्लोन के समानांतर चयन दिखाता है कि विस्तार से वर्णन किया गया है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करना, एक ही उपयोगकर्ता एंटीजन के सैकड़ों उत्पन्न कर सकते हैं,समानांतर में उन्हें एंटीबॉडी का चयन करें और 6-8 हफ्तों के भीतर बाध्यकारी एंटीबॉडी मान्य। हाइलाइट किया जाता है: मैं) एक व्यवहार्य प्रतिजन प्रारूप, द्वितीय) पूर्व चयन प्रतिजन लक्षण, III) गंभीर विशिष्ट और उच्च आत्मीयता क्लोन के चयन को प्रभावित करने वाले कदम है, और चतुर्थ) की निगरानी के चयन प्रभावशीलता और प्रारंभिक चरण एंटीबॉडी क्लोन लक्षण वर्णन करने के तरीके। इस दृष्टिकोण के साथ, हम एकल पास झिल्ली रिसेप्टर्स, स्रावित प्रोटीन हार्मोन, और बहु-डोमेन intracellular प्रोटीन सहित कई लक्ष्य वर्गों के लिए सिंथेटिक एंटीबॉडी टुकड़े (Fabs) प्राप्त किया है। इन टुकड़ों को तत्काल पूर्ण लंबाई एंटीबॉडी के लिए परिवर्तित कर रहे हैं और उच्च आत्मीयता और विशिष्टता प्रदर्शन करने के लिए मान्य किया गया है। इसके अलावा, वे पश्चिमी सोख्ता, एलिसा, सेलुलर इम्यूनोफ्लोरेसेंस, immunoprecipitation और संबंधित assays के सहित मानक immunoassays की एक किस्म में कार्य करने का प्रदर्शन किया गया है। इस पद्धति एंटीबॉडी की खोज में तेजी लाने और अंततः लक्ष्य ओ को साकार करने के लिए करीब हमें लाना होगाएफ proteome के लिए अक्षय, उच्च गुणवत्ता वाले एंटीबॉडी पैदा होता है।
Introduction
पोस्ट-जीनोमिक उम्र की शुरुआत के साथ, विशेषताएँ और प्रोटीन मिलाना करने के लिए उच्च गुणवत्ता के बंधन अभिकर्मकों की उपलब्धता के नए अनुसंधान और चिकित्सीय रास्ते खोलने के लिए आवश्यक है। एंटीबॉडी बुनियादी अनुसंधान और नैदानिक उपकरण और संभावित चिकित्सा विज्ञान के रूप में दोनों शैक्षणिक और औद्योगिक शोधकर्ताओं के लिए महत्वपूर्ण हो रहे हैं। आश्चर्य नहीं कि कस्टम एंटीबॉडी उत्पन्न करने के लिए पारंपरिक हाइब्रिडोमा प्रौद्योगिकियों पर भरोसा करते हैं, जिनमें से अधिकांश अनुबंध एंटीबॉडी विकास फर्मों, के एक प्रभावशाली वृद्धि हुई है। फिर भी, फेज-प्रदर्शित एंटीबॉडी पुस्तकालयों का उपयोग कर इन विट्रो चयन परम्परागत तकनीकों सीमाओं 1, 2 का सामना कर सकते हैं जहां अद्वितीय फायदे और सफलता की पेशकश कर सकते हैं कि एक शक्तिशाली वैकल्पिक प्रौद्योगिकी होता जा रहा है।
अनुसंधान उपकरण, पैदा करने के लिए दो प्राथमिक चुनौतियों के रूप में उच्च गुणवत्ता वाले एंटीबॉडी के लिए काफी मांग के आलोक में अक्षय एंटीबॉडी 1) चयन throughput और 2) प्रतिजन ए वी कर रहे हैंailability। समूहों की संख्या अब throughput और एंटीबॉडी पहचान की दर बढ़ाने के उद्देश्य से इन विट्रो चयन पाइपलाइनों में वर्णन किया है। ये विवरण विस्तार से पूर्ण लंबाई या तो पर चयन शामिल है कि आर्थिक रूप से व्यावहारिक दृष्टिकोण की एक किस्म का उपयोग, 3,4 को लक्षित करता है, या संरचनात्मक रूप डोमेन के 5,6,7 संबंधित या तो मनका-आधारित 6,8 या 3,4 प्रतिजन स्थिरीकरण योजनाओं आधारित थाली। इसके अलावा, जीन संश्लेषण प्रौद्योगिकियों 9 के बढ़ते गोद लेने यथोचित लागत प्रभावी और संभावित शुद्ध, पूर्ण लंबाई प्रतिजन के लिए पर्याप्त मात्रा में प्राप्त करने में कठिनाई कम कर सकते हैं, विशेष रूप से अलग डोमेन की, व्यवस्थित प्रतिजन पीढ़ी बना दिया है। मिलकर में दो प्रौद्योगिकियों का उपयोग करके, एक घुन्ना और स्केलेबल प्रतिजन पीढ़ी और एंटीबॉडी चयन पाइपलाइन व्यक्त प्रतिजन डोमेन के बड़े सेट के लिए एंटीबॉडी के समानांतर अलगाव को सक्षम और चा के लिए अभिकर्मकों के विकास की सुविधा होगी कि तैयार किया गया थासंरचनात्मक रूप या कार्यात्मक रूप से संबंधित प्रोटीन की पूरी वर्गों racterizing।
इस उद्देश्य के लिए, व्यक्त प्रतिजन डोमेन, जीन संश्लेषण, एंटीजन और स्केलेबल फेज-प्रदर्शित एंटीबॉडी चयन के उच्च throughput बैक्टीरियल अभिव्यक्ति की सिलिको पहचान में जोड़े विकसित किया गया है कि एक एकीकृत पाइप लाइन की ओर। इस पाइपलाइन (लाइसेंस या सामग्री हस्तांतरण समझौते के माध्यम से तेजी से उपलब्ध हैं, जो एंटीबॉडी पुस्तकालयों सहित) सबसे जीवन विज्ञान प्रयोगशालाओं के लिए ही उपलब्ध आधारभूत संरचना की आवश्यकता है, लेकिन यह भी एक औद्योगिक पैमाने पर उपयोग के लिए स्वचालन करने के लिए उत्तरदायी है। इस प्रोटोकॉल का प्रयोग, यह आत्मीयता टैग प्रतिजन डोमेन के सैकड़ों उत्पन्न करने के लिए संभव है, और नियमित रूप से इन एंटीजन के कई लोगों के लिए अत्यधिक विशिष्ट एंटीबॉडी टुकड़े को अलग।
फेज प्रदर्शन प्रौद्योगिकी फैब, scFv, और स्वायत्त Fv डोमेन और एक सहित पुनः संयोजक आत्मीयता अभिकर्मक प्रारूपों की एक विस्तृत विविधता के साथ प्रदर्शन किया अनुकूलता दिखाया गया हैछोटे 'वैकल्पिक व्यवस्थाएं' (डिजाइन किए ankyrin दोहराने प्रोटीन (DARPINS), फ़ाइब्रोनेक्टिन (एफ एन), lipocalin डोमेन और अधिक 10) की बढ़ती सरणी। यह इन तरीकों पुस्तकालयों के अन्य प्रकार के लिए अनुकूलित किया जा सकता है माना जाता है, हालांकि चर्चा, फैब एंटीबॉडी टुकड़े के अलगाव के लिए इस उदाहरण में प्रतिबंधित है। इस प्रौद्योगिकी का उपयोग करना, छोटा करने के लिए कम nanomolar आत्मीयता के साथ Fabs, पूर्ण लंबाई प्रोटीन बाँध और ऐसे इम्यूनोफ्लोरेसेंस के रूप में immunoassays में कार्य कर रहे हैं, जिनमें से कई शाही सेना बाध्यकारी प्रोटीन और दूसरों को सफलतापूर्वक चयनित किया गया है प्रतिलेखन कारक डोमेन, SH2 डोमेन, सहित प्रोटीन डोमेन में चिह्नित , immunoprecipitation और immunohistochemistry। महत्वपूर्ण बात है, पुनः संयोजक बंधन क्लोन पूरी तरह से अक्षय कर रहे हैं और अभिव्यक्ति से फिर से उत्पन्न किया जा सकता है, इस प्रकार के कठोर क्लोन सत्यापन की कीमत को न्यायोचित ठहरा, बैक्टीरियल उत्पादन भेंट वृद्धि की स्थिरता, reproducibility और लागत प्रभावशीलता के माध्यम से निर्माण करती है।
इस prot मेंocol और साथ वीडियो, स्थिर प्रतिजन डोमेन का उपयोग फेज-प्रदर्शित पुस्तकालयों से एंटीबॉडी के चयन के लिए बुनियादी तरीकों का प्रदर्शन कर रहे हैं। अन्य टैग 11,12,13 और चयन प्रारूपों भी सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है 13,14,2 हालांकि इस विशेष विधि, microwell प्लेटों में निष्क्रिय सोखना द्वारा immobilized जीएसटी टैग प्रोटीन डोमेन कार्यरत हैं। पहचान और सत्यापन के लिए विशेष रूप से समृद्ध प्रतिरूप एंटीबॉडी को अलग-थलग करने के उद्देश्य से चयन मापदंडों के समानांतर निगरानी के साथ चयन की स्थापना और संचालन के लिए महत्वपूर्ण विचार विस्तृत रहे हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
इन विट्रो एंटीबॉडी चयन में आयोजित करते हैं, चयन सफलता के दो प्राथमिक निर्धारकों पर चयन के लिए) अच्छी तरह से मुड़ा हुआ प्रतिजनी लक्ष्य के अलगाव हैं 1 और 2) एक उच्च कार्यात्मक विविधता एंटीबॉडी पुस्त?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम एनआईएच आम कोष स्वीकार करना चाहते हैं – प्रोटीन कैद अभिकर्मकों कार्यक्रम संयोजक एंटीबॉडी नेटवर्क एंटीबॉडी चयन और लक्षण वर्णन पाइपलाइन और रोबोट चयन मंच के वित्त पोषण खरीद के लिए अभिनव के लिए कनाडा फाउंडेशन के विकास के वित्त पोषण के लिए।
Materials
| MATERIALS | |||
| Name | Company | Catalog Number | |
| New Brunswick Innova44 stackable incubator shaker | Eppendorf | M1282-0004 | |
| Liquidator 96 channel manual benchtop pipetting system | Anachem Ltd | LIQ-96-200 | |
| Microplate shaker | VWR | 12620-926 | |
| ThermoScientific Sorvall ST-40 benchtop centrifuge | Thermo Product | 75004525 | |
| ELx405 Select Deep Well Microplate Washer | Biotek | ELX405USD | |
| Custom High Throughput Automated Phage Selection Robot | S&P Robotics | ||
| Plastic conical Falcon tube: 50 mL | VWR | 21008-178 | |
| Plastic conical Falcon tube: 15 mL | VWR | 89039-668 | |
| Axygen 1.7 mL microcentrifuge tubes | Corning | MCT-175-L-C | |
| 96-well/384-well Maxisorp plate | Sigma | M9410-1CS | |
| Corning 96-well V-bottom deep-well block | Corning | 3960 | |
| Axygen Mini-tube 96-well sterile microplate blue box | Corning | AXY-MTS-06-C-R-S | |
| Breathable adhesive plate sealing film | VWR | 60941-084 | |
| REAGENTS | |||
| Name | Company | Catalog Number | |
| polyethylene glycol | Bioshop | PEG800.1 | |
| yeast extract | Bioshop | YEX401.1 | |
| bio-tryptone | Bioshop | TRP402.1 | |
| N-Z amine | Sigma | C7290 | |
| glucose | Sigma | G8270-1KG | |
| lactose | Bioshop | LAC234 | |
| glycerol | Bioshop | GLY001.500 | |
| carbenicillin | Bioshop | CAR544.10 | |
| kanamycin | Bioshop | KAN201.25 | |
| tetracycline | Bioshop | TET701.25 | |
| Tween 20 | Bioshop | TWN510.500 | |
| monobasic potassium phophate | Bioshop | PPM302.1 | |
| dibasic sodium phosphate | Anachemia | 84486-440 | |
| sodium chloride | Bioshop | SOD001.10 | |
| potassium chloride | Bioshop | POC308.1 | |
| calcium chloride | Bioshop | CCL302.500 | |
| magnesium sulphate | EMD | MX0070-1 | |
| magnesium chloride | Bioshop | MAG510.500 | |
| NH4Cl | Amresco | 0621-1KG | |
| Na2SO4 | Bioshop | SOS513.500 | |
| agar | Bioshop | AGR001.500 | |
| SybrSafe DNA gel stain | Invitrogen | S33102 | |
| phosphoric acid | Acros Organics | 201140010 | |
| lysozyme | Bioshop | LYS702.25 | |
| benzonase | Novagen | 71205 | |
| Triton X-100 | Bioshop | TRX506.500 | |
| protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 11 836 170 001 | |
| Ni-NTA resin | Qiagen | 1018240 | |
| 1000x helper phage (M13K07) stock (1013 phage per mL) | NEB | N0315S | |
| HRP conjugated M13-specific antibody (anti-M13-HRP). | GE Healthcare | 27-9241-01 | |
| TMB substrate: mix equal volumes of TMB and H2O2 peroxidase substrate | KPL | 50-76-00 | |
| dNTPs | Biobasic | DD0056 | |
| Taq polymerase | Genscript | E00007 | |
| Exonuclease | GE Healthcare | EZ0073X-EZ | |
| Shrimp alkaline phosphatase | GE Healthcare | E70092Z-EZ | |
Referências
- Winter, G., Milstein, C. Man-made antibodies. Nature. 349, 293-299 (1991).
- Miersch, S., Sidhu, S. S. Synthetic antibodies: concepts, potential and practical considerations. Methods. 57, 486-498 (2012).
- Schofield, D. J., et al. Application of phage display to high throughput antibody generation and characterization. Genome Biol. 8, R254 (2007).
- Hust, M., et al. A human scFv antibody generation pipeline for proteome research. J. Biotechnol. 152, 159-170 (2011).
- Colwill, K., Graslund, S. A roadmap to generate renewable protein binders to the human proteome. Nat. Methods. 8, 551-558 (2011).
- Mersmann, M., et al. Towards proteome scale antibody selections using phage display. Nat. Biotechnol. 27, 118-128 (2010).
- Pershad, K., et al. Generating a panel of highly specific antibodies to 20 human SH2 domains by phage display. Protein Eng. Des. Sel. 23, 279-288 (2010).
- Turunen, L., Takkinen, K., Soderlund, H., Pulli, T. Automated panning and screening procedure on microplates for antibody generation from phage display libraries. J Biomol. Screen. 14, 282-293 (2009).
- Hughes, R. A., Miklos, A. E., Ellington, A. D. Gene synthesis: methods and applications. Methods Enzymol. 498, 277-309 (2011).
- Boersma, Y. L., Pluckthun, A. DARPins and other repeat protein scaffolds: advances in engineering and applications. 22, 849-857 (2011).
- Terpe, K. Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl. Microbiol. Biotechnol. 60, 523-533 (2003).
- Lichty, J. J., Malecki, J. L., Agnew, H. D., Michelson-Horowitz, D. J., Tan, S. Comparison of affinity tags for protein purification. Protein Expr. Purif. 41, 98-105 (2005).
- Fellouse, F. A., et al. High-throughput generation of synthetic antibodies from highly functional minimalist phage-displayed libraries. J. Mol. Biol. 373, 924-940 (2007).
- Paduch, M., et al. Generating conformation-specific synthetic antibodies to trap proteins in selected functional states. Methods. 60, 3-14 (2013).
- Studier, F. W. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Protein Expr. Purif. 41, 207-234 (2005).
- Huang, H., Sidhu, S. S. Studying binding specificities of peptide recognition modules by high-throughput phage display selections. Methods Mol. Biol. 781, 87-97 (2011).
- McLaughlin, M. E., Sidhu, S. S. Engineering and analysis of peptide-recognition domain specificities by phage display and deep Sequencing. Methods Enzymol. 523, 327-349 (2013).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
- den Engelsman, J., et al. Strategies for the assessment of protein aggregates in pharmaceutical biotech product development. Pharm. Res. 28, 920-933 (2011).
- Lavinder, J. J., Hari, S. B., Sullivan, B. J., Magliery, T. J. High-throughput thermal scanning: a general, rapid dye-binding thermal shift screen for protein engineering. J. Am. Chem. Soc. 131, 3794-3795 (2009).
- Fellouse, F. A., Sidhu, S. S., Howard, G. C., MR, K. a. s. e. r. . Making antibodies in bacteria. in Making and Using Antibodies: A Practical Handbook. , 151-172 (2013).
- Acton, T. B., et al. Preparation of protein samples for NMR structure, function, and small-molecule screening studies. Methods in Enzymology. 483, 23-47 (2011).
- Mahon, C. M., et al. Comprehensive interrogation of a minimalist synthetic CDR-H3 library and its ability to generate antibodies with therapeutic potential. J. Mol. Biol. 425, 1712-1730 (2013).
- Persson, H., et al. CDR-H3 diversity is not required for antigen recognition by synthetic antibodies. J. Mol. Biol. 425, 803-811 (2013).
- Bradbury, A. R., Sidhu, S., Dubel, S., McCafferty, J. Beyond natural antibodies: the power of in vitro display technologies. Nat. Biotechnol. 29, 245-254 (2011).
