Method Article

Selecção de alta Scalable Rendimento de bibliotecas de anticorpos em fagos sintética exibida-

DOI:

10.3791/51492

⸱

January 17th, 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The Recombinant Antibody Network, 2The Banting and Best Department of Medical Research, University of Toronto, 3Antibiome Center, University of California, San Francisco at Mission Bay, 4Department of Biochemistry and Molecular Biology, The University of Chicago

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Um método é descrito com acompanhamento visual para a realização escaláveis, selecções de alto rendimento de bibliotecas combinatórias de anticorpos sintéticos exibidos em fagos contra centenas de antigénios simultaneamente. Usando esta abordagem paralela, isolámos fragmentos de anticorpos que exibem uma elevada afinidade e especificidade para diversos antígenos que são funcionais em imunoensaios convencionais.

Abstract

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A demanda por anticorpos que atendam às necessidades de ambas as aplicações básicas e clínicas de pesquisa é alto e vai aumentar drasticamente no futuro. No entanto, é evidente que as tecnologias tradicionais não são monoclonais sozinho até esta tarefa. Isto conduziu ao desenvolvimento de métodos alternativos para satisfazer a procura de alta qualidade e reagentes de afinidade renováveis ​​para todos os elementos acessíveis do proteoma. Para este fim, os métodos de alto rendimento para a realização de seleções a partir de bibliotecas de anticorpos sintéticos exibido em fagos foram concebidos para aplicações que envolvem diversos antígenos e otimizado para o rendimento e sucesso rápido. Nisto, um protocolo é descrito em detalhe que ilustra com demonstração de vídeo a selecção de clones paralelo Fab-fago a partir de bibliotecas de alta diversidade contra centenas de alvos quer utilizando um manipulador de líquidos 96 canal manual ou sistema de robótica automatizado. Usando este protocolo, um único usuário pode gerar centenas de antígenos,selecionar anticorpos para-los em paralelo e validar a ligação do anticorpo dentro de 6-8 semanas. Destacam-se: i) um formato de antígeno viável, ii) caracterização antígeno pré-selecção, iii) passos críticos que influenciam a seleção de clones específicos de afinidade e alta, e iv) formas de eficácia seleção monitoramento e fase inicial de anticorpos clone caracterização. Com esta abordagem, temos obtido os fragmentos de anticorpos sintéticos (FAB) para muitas classes alvo, incluindo os receptores de uma só passagem de membrana, hormônios proteína secretada e proteínas intracelulares multi-domínio. Estes fragmentos são facilmente convertidos em anticorpos de comprimento total e foram validados para apresentar uma elevada afinidade e especificidade. Além disso, eles têm sido demonstrados para ser funcional em uma variedade de imunoensaios convencionais, incluindo Western blot, ELISA, imunofluorescência celular, ensaios de imunoprecipitação e afins. Esta metodologia irá acelerar a descoberta de anticorpos e, finalmente, trazer-nos mais perto de realizar o objetivo of gerar anticorpos qualidade renováveis, elevadas para o proteoma.

Introduction

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Com o início da era pós-genômica, a disponibilidade de reagentes de ligação de alta qualidade para caracterizar e modular proteínas é fundamental para abrir novas pesquisas e avenidas terapêuticas. Os anticorpos continuam a ser fundamentais para ambos os pesquisadores acadêmicos e industriais como a pesquisa básica e ferramentas de diagnóstico e terapêuticas potenciais. Não surpreendentemente, tem havido um crescimento impressionante de empresas de desenvolvimento de anticorpos contrato, a maioria dos que dependem de tecnologias de hibridoma convencionais para gerar anticorpos personalizados. No entanto, a seleção in vitro utilizando bibliotecas de anticorpo....

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Protocol

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1. Antigen Generation

NOTA: os domínios de antigénios pode ser sintetizado e clonado por uma variedade de fornecedores comerciais para uma construção de expressão de IPTG induzível adequado.

  1. Transformar as construções de expressão em quimicamente competente, T1-fago resistente, BL21 E. células de E. coli por mistura de 10 ng de ADN que codifica em 20 ul de 1X KCM sobre gelo numa placa de 96 poços de PCR, seguida pela adição de 20 L de células quimicamente competentes.
  2. Incubar a mistura de célula / DNA em gelo durante 20 min, à RT durante 10 min e, em seguida, novamente em gelo durante 2 min antes de ....

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Results

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O protocolo aqui descrito foi utilizado para isolar fragmentos de anticorpo a uma variedade de ambos os domínios de antigénios structurally- e funcionalmente relacionados com o de bibliotecas combinatórias exibida por fagos de Fab em paralelo. Problemas relacionados com a disponibilidade de antigénio pode ser contornado, em muitos casos, por na identificação de domínios de antigénios silico expressáveis ​​que são apropriados para selecção de anticorpos 23. Ao acoplar a expressão de antigénio para selecção de .......

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Discussion

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Ao conduzir em selecções de anticorpos in vitro, os dois principais determinantes do sucesso selecção são 1) o isolamento de alvos antigénicos bem dobradas para a selecção em cima e 2) a disponibilidade de uma biblioteca de anticorpos de alta diversidade funcional. Em muitos casos, a disponibilidade de quantidades suficientes de bem-dobradas, proteína de comprimento completo pode ser limitante. Uma abordagem para superar esta limitação é a utilização de domínios identificados a partir da análise de bio.......

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Disclosures

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Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgements

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Gostaríamos de agradecer o Fundo Comum do NIH - Protein Programa de reagentes de captura para financiar o desenvolvimento da seleção anticorpo recombinante e caracterização gasoduto Antibody Rede e da Fundação Canadense para Inovação para a compra financiamento da plataforma seleção robótico.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
MATERIAIS
Novo agitador de incubadora empilhável Brunswick Innova44EppendorfM1282-0004
Liquidator Sistema de pipetagem de bancada manual de 96 canaisAnachem LtdLIQ-96-200
Agitador de microplacasVWR12620-926
ThermoScientific Sorvall ST-40 centrífuga de bancadaThermo Product
ELx405 Selecione a arruela de microplacas de poço profundoBiotekELX405USD
Robô automatizado de seleção de fagos de alto rendimento personalizadoS & P Robotics
Tubo de falcão cónico de plástico: 50 mlVWR21008-178
Tubo de plástico cónico Falcon: 15 mlVWR89039-668
microcentrífuga Axygen de 1,7 ml PlacaMaxisorp
SigmaM9410-1CS
Bloco de poços profundos com fundo em V de 96 poços CorningCorning3960
Axygen Mini-tubo Microplaca estéril de 96 poços caixa azulCorningAXY-MTS-06-C-R-S
Película de vedação de placa adesiva respirávelVWR60941-084
REAGENTES
NomeEmpresaNúmero de
polietilenoglicolBioshopPEG800.1
extrato de leveduraBioshopYEX401.1
bio-triptonaBioshopTRP402.1
N-Z aminaSigmaC7290
glicoseSigmaG8270-1KG
lactoseBioshopLAC234
glicerolBioshopGLY001.500
carbenicilina BioshopCAR544.10
canamicinaBioshopKAN201.25
tetraciclina BioshopTET701.25
Tween 20BioshopTWN510.500
fosfato de potássio monobásicoBioshopPPM302.1
fosfato de sódio dibásicoAnachemia84486-440
cloreto de sódioBioshopSOD001.10
cloreto de potássioBioshopPOC308.1
cloreto de cálcioBioshopCCL302.500
sulfato de magnésioEMDMX0070-1
cloreto de magnésioBioshopMAG510.500
NH4ClAmresco0621-1KG
Na2SO4BioshopSOS513.500
ágarBioshopAGR001.500
SybrSafe DNA gel coranteInvitrogenS33102
ácido fosfóricoAcros Organics201140010
lisozimaBioshopLYS702.25
benzonaseNovagen71205
Triton X-100BioshopTRX506.500
coquetel inibidor de protease comprimidosRoche11 836 170 001
Resina Ni-NTA Qiagen1018240
estoque de 1.000x fagos auxiliares (M13K07) (1013 fago por ml)NEBN0315S
HRP conjugado com anticorpos específicos M13-HRP (anti-M13-HRP).GE Healthcare27-9241-01
Substrato TMB: misture volumes iguais de substrato TMB e H2O2 peroxidase KPL50-76-00
dNTPsBiobasicDD0056
Taq polimeraseGenscriptE00007
ExonucleaseGE Healthcare EZ0073X-EZ
Fosfatase alcalina de camarãoGE HealthcareE70092Z-EZ
75004525Tubos de de 96 poços/384 poços Corning catálogo

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Winter, G., Milstein, C. Man-made antibodies. Nature. 349, 293-299 (1991).
  2. Miersch, S., Sidhu, S. S. Synthetic antibodies: concepts, potential and practical considerations. Methods. 57, 486-498 (2012).
  3. Schofield, D. J., et al.

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Phage DisplayAntibody SelectionHigh ThroughputSynthetic LibrariesFab PhageAntigen ImmobilizationParallel SelectionLiquid HandlerRobotic AutomationELISA Validation

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