Escalable de alto rendimiento seleccion de bibliotecas de anticuerpos sintéticos fagos
Summary
Se describe un método con acompañamiento visual para conducir, las selecciones de rendimiento altos escalables de bibliotecas de anticuerpos sintéticos combinatorios fagos contra cientos de antígenos simultáneamente. El uso de este enfoque paralelo, hemos aislado fragmentos de anticuerpos que exhiben alta afinidad y especificidad para diversos antígenos que son funcionales en inmunoensayos estándar.
Abstract
La demanda de los anticuerpos que se satisfagan las necesidades de las aplicaciones básicas y clínicas de investigación es alta y se incrementará dramáticamente en el futuro. Sin embargo, es evidente que las tecnologías tradicionales no son monoclonales solo hasta esta tarea. Esto ha llevado al desarrollo de métodos alternativos para satisfacer la demanda de alta calidad y reactivos de afinidad renovables a todos los elementos accesibles del proteoma. Con este fin, métodos de alto rendimiento para la realización de selecciones de bibliotecas de anticuerpos en fagos sintéticos se han diseñado para aplicaciones que implican diversos antígenos y optimizado para un rendimiento rápido y el éxito. En la presente memoria, un protocolo se describe en detalle que ilustra con la demostración de vídeo la selección paralela de clones Fab fagos a partir de bibliotecas de alta diversidad contra cientos de objetivos usando un manipulador de líquidos 96 manual de canales o el sistema de robótica automatizada. El uso de este protocolo, un solo usuario puede generar cientos de antígenos,seleccionar anticuerpos a ellos en paralelo y validar la unión de anticuerpos dentro de 6-8 semanas. Se destacan: i) un formato antígeno viable, ii) caracterización del antígeno preselección, iii) los pasos críticos que influyen en la selección de clones específicos y de alta afinidad, y iv) las formas de efectividad selección monitoreo y etapa temprana caracterización anticuerpo clon. Con este enfoque, hemos obtenido fragmentos de anticuerpos sintéticos (FABS) a muchas clases de objetivos, incluyendo los receptores de un solo paso de membrana, hormonas de proteínas secretadas y proteínas intracelulares multi-dominio. Estos fragmentos se convierten fácilmente a los anticuerpos de longitud completa y se han validado para exhibir una alta afinidad y especificidad. Además, se han demostrado para ser funcionales en una variedad de inmunoensayos estándar, incluyendo transferencia de Western, ELISA, inmunofluorescencia celular, inmunoprecipitación y ensayos relacionados. Esta metodología se acelerará el descubrimiento de anticuerpos y en última instancia, nos acercan a la realización del objetivo of generación de anticuerpos de alta calidad, renovables a la proteoma.
Introduction
Con el inicio de la era post-genómica, la disponibilidad de reactivos de unión de alta calidad para caracterizar y modular proteínas es esencial para abrir nuevas investigaciones y vías terapéuticas. Los anticuerpos siguen siendo fundamentales para los investigadores académicos e industriales como la investigación básica y las herramientas de diagnóstico y terapéuticos potenciales. No en vano, se ha registrado un impresionante crecimiento de las empresas de desarrollo de anticuerpos contrato, la mayoría de los cuales se basan en tecnologías de hibridoma convencionales para generar anticuerpos personalizados. Sin embargo, la selección in vitro usando bibliotecas de anticuerpos en fagos se está convirtiendo en una tecnología poderosa alternativa que puede ofrecer ventajas únicas y éxito donde las tecnologías convencionales pueden enfrentar limitaciones 1, 2.
A la luz de la considerable demanda de anticuerpos de alta calidad como herramientas de investigación, dos retos principales para la generación de anticuerpos renovables son 1) el rendimiento de la selección y 2) av antígenodimensiones pueden ser. Un número de grupos han descrito en las tuberías de selección in vitro destinadas a aumentar el rendimiento y la tasa de identificación de anticuerpos. Estas descripciones detalle una variedad de enfoques viables que incluyen la selección a ya sea de longitud completa se dirige a 3,4, o dominios 5,6,7 estructuralmente relacionado, utilizando ya sea 6,8 o placa de base 3,4 esquemas de inmovilización del antígeno basado en perlas. Además, la creciente adopción de las tecnologías de síntesis de genes 9 ha hecho la generación de antígeno sistemática, en particular de dominios aislados, razonablemente rentable y puede potencialmente aliviar la dificultad en la obtención de cantidades suficientes de antígeno purificado, de longitud completa. Mediante el uso de las dos tecnologías en tándem, un oleoducto autónomo y generación antígeno escalable y selección de anticuerpos se ideó que permita el aislamiento paralelo de anticuerpos para grandes conjuntos de dominios de antígenos expresados y facilitar el desarrollo de reactivos para characterizing clases enteras de proteínas estructuralmente o funcionalmente relacionados.
Con este objetivo, un gasoducto integrado que las parejas en la identificación in silico de dominios antígeno expresables, síntesis de genes, expresión bacteriana de alto rendimiento de antígenos y escalables fagos selecciones de anticuerpos se ha desarrollado. Este gasoducto requiere sólo la infraestructura básica disponible para la mayoría de los laboratorios de ciencias de la vida (incluidas las bibliotecas de anticuerpos que son cada vez más accesibles a través de un acuerdo de licencia o de transferencia de material), pero también es susceptible de automatización para el uso a escala industrial. El uso de este protocolo, es posible generar cientos de dominios antigénicos de afinidad de etiquetado, y aislar fragmentos de anticuerpos rutinariamente altamente específicos para muchos de estos antígenos.
La tecnología de presentación en fagos ha demostrado demostrado la compatibilidad con una amplia variedad de formatos de reactivo de afinidad recombinantes incluyendo Fab, scFv, Fv y los dominios autónomos y unacreciente variedad de pequeños "marcos alternativos" (proteínas ankyrin repetir diseñados (DARPins), fibronectina (FN), dominios de lipocalina y más 10). Discusión se limita en este ejemplo para el aislamiento de fragmentos de anticuerpos Fab, aunque se presume que estos métodos pueden adaptarse a otros tipos de bibliotecas. Utilizando esta tecnología, los Fab con baja afinidad nanomolar a pequeña, etiquetados dominios de la proteína incluyendo dominios del factor de transcripción, dominios SH2, proteínas y otros ARN vinculante se han seleccionado con éxito, muchos de los que se unen para pedir una proteína y son funcionales en inmunoensayos, como la inmunofluorescencia , inmunoprecipitación e inmunohistoquímica. Es importante destacar que los clones de unión recombinantes son totalmente renovable y se puede volver a generar a partir de construcciones de expresión a través de la producción bacteriana oferta mayor coherencia, la reproducibilidad y la rentabilidad, lo que justifica el gasto de validación clon riguroso.
En este protocol y video que lo acompaña, se demuestran los métodos básicos para la selección de anticuerpos de bibliotecas de fagos utilizando dominios de antígenos inmovilizados. Este método particular emplea dominios de la proteína marcada con GST inmovilizado por adsorción pasiva en placas de micropocillos, aunque otras etiquetas 11,12,13 y formatos de selección 13,14,2 también se han utilizado con éxito. Consideraciones críticas para la configuración y el comportamiento de las selecciones con control paralelo de parámetros de selección destinados a identificar y aislar anticuerpos monoclonales específicamente enriquecidos para la validación se detallan.
Protocol
Representative Results
Discussion
Al llevar a cabo en la selección de anticuerpos in vitro, los dos determinantes principales de éxito selección son 1) el aislamiento de dianas antigénicas bien plegadas para seleccionar sobre y 2) la disponibilidad de una biblioteca de anticuerpos de alta diversidad funcional. En muchos casos, la disponibilidad de cantidades suficientes de bien plegada, proteína de longitud completa puede ser limitante. Un enfoque para superar esta limitación es el uso de dominios identificados a partir del anál…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría reconocer el Fondo Común NIH – Proteína Programa de reactivos de captura para financiar el desarrollo de la selección y caracterización de anticuerpos tubería recombinante de anticuerpos de red y de la Fundación Canadiense para la Innovación para la compra de financiación de la plataforma de selección robótica.
Materials
| MATERIALS | |||
| Name | Company | Catalog Number | |
| New Brunswick Innova44 stackable incubator shaker | Eppendorf | M1282-0004 | |
| Liquidator 96 channel manual benchtop pipetting system | Anachem Ltd | LIQ-96-200 | |
| Microplate shaker | VWR | 12620-926 | |
| ThermoScientific Sorvall ST-40 benchtop centrifuge | Thermo Product | 75004525 | |
| ELx405 Select Deep Well Microplate Washer | Biotek | ELX405USD | |
| Custom High Throughput Automated Phage Selection Robot | S&P Robotics | ||
| Plastic conical Falcon tube: 50 mL | VWR | 21008-178 | |
| Plastic conical Falcon tube: 15 mL | VWR | 89039-668 | |
| Axygen 1.7 mL microcentrifuge tubes | Corning | MCT-175-L-C | |
| 96-well/384-well Maxisorp plate | Sigma | M9410-1CS | |
| Corning 96-well V-bottom deep-well block | Corning | 3960 | |
| Axygen Mini-tube 96-well sterile microplate blue box | Corning | AXY-MTS-06-C-R-S | |
| Breathable adhesive plate sealing film | VWR | 60941-084 | |
| REAGENTS | |||
| Name | Company | Catalog Number | |
| polyethylene glycol | Bioshop | PEG800.1 | |
| yeast extract | Bioshop | YEX401.1 | |
| bio-tryptone | Bioshop | TRP402.1 | |
| N-Z amine | Sigma | C7290 | |
| glucose | Sigma | G8270-1KG | |
| lactose | Bioshop | LAC234 | |
| glycerol | Bioshop | GLY001.500 | |
| carbenicillin | Bioshop | CAR544.10 | |
| kanamycin | Bioshop | KAN201.25 | |
| tetracycline | Bioshop | TET701.25 | |
| Tween 20 | Bioshop | TWN510.500 | |
| monobasic potassium phophate | Bioshop | PPM302.1 | |
| dibasic sodium phosphate | Anachemia | 84486-440 | |
| sodium chloride | Bioshop | SOD001.10 | |
| potassium chloride | Bioshop | POC308.1 | |
| calcium chloride | Bioshop | CCL302.500 | |
| magnesium sulphate | EMD | MX0070-1 | |
| magnesium chloride | Bioshop | MAG510.500 | |
| NH4Cl | Amresco | 0621-1KG | |
| Na2SO4 | Bioshop | SOS513.500 | |
| agar | Bioshop | AGR001.500 | |
| SybrSafe DNA gel stain | Invitrogen | S33102 | |
| phosphoric acid | Acros Organics | 201140010 | |
| lysozyme | Bioshop | LYS702.25 | |
| benzonase | Novagen | 71205 | |
| Triton X-100 | Bioshop | TRX506.500 | |
| protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 11 836 170 001 | |
| Ni-NTA resin | Qiagen | 1018240 | |
| 1000x helper phage (M13K07) stock (1013 phage per mL) | NEB | N0315S | |
| HRP conjugated M13-specific antibody (anti-M13-HRP). | GE Healthcare | 27-9241-01 | |
| TMB substrate: mix equal volumes of TMB and H2O2 peroxidase substrate | KPL | 50-76-00 | |
| dNTPs | Biobasic | DD0056 | |
| Taq polymerase | Genscript | E00007 | |
| Exonuclease | GE Healthcare | EZ0073X-EZ | |
| Shrimp alkaline phosphatase | GE Healthcare | E70092Z-EZ | |
Referências
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