Skalbar hög genomströmning Urval Från faguppvisade Syntetiska Antibody bibliotek
Summary
En metod beskrivs med visuell ackompanjemang för att bedriva skalbara, hög genomströmning val från faguppvisade kombi syntetiska antikroppsbibliotek mot hundratals antigener samtidigt. Med användning av detta parallellt tillvägagångssätt, har vi isolerat antikroppsfragment som uppvisar hög affinitet och specificitet för olika antigener som är funktionella i standardimmunanalyser.
Abstract
Efterfrågan på antikroppar som uppfyller behoven hos både grundläggande och klinisk forskningsansökningar är hög och kommer att dramatiskt öka i framtiden. Det är dock uppenbart att de traditionella monoklonala tekniker är inte ensam upp till denna uppgift. Detta har lett till utvecklingen av alternativa metoder för att tillgodose kraven på hög kvalitet och förnybara affinitetsreagens för alla tillgängliga delar av proteomet. För detta ändamål, har hög genomströmning metoder för att genomföra val från faguppvisade syntetiska antikroppsbibliotek tagits fram för tillämpningar där olika antigener och optimerad för snabb genomströmning och framgång. Häri är ett protokoll som beskrivs i detalj som illustrerar med videodemonstration parallell urvalet av Fab-fagkloner från höga bibliotek mångfalds mot hundratals mål med hjälp av antingen en manuell 96 kanals vätskehanterare eller automatiserade robotsystem. Med hjälp av detta protokoll, kan en enskild användare genererar hundratals antigener,Välj antikroppar mot dem parallellt och validera antikroppsbindning inom 6-8 veckor. Markerad är: i) en livskraftig antigenformat, ii) preliminära urvalet antigen karakterisering, iii) kritiska steg som påverkar valet av specifika och höga affinitet kloner, och iv) metoder för övervakning urvals effektivitet och tidigt antikropps klon karakterisering. Med denna metod har vi fått syntetiska antikroppsfragment (Fabs) till många målklasser inklusive enkelpassmembranreceptorer, utsöndrade proteinhormoner, och multi-domän intracellulära proteiner. Dessa fragment lätt omvandlas till fullängds antikroppar och har validerats för att uppvisa hög affinitet och specificitet. Vidare har de visats vara funktionell i en mängd olika standardimmunanalyser inklusive Western blotting, ELISA, cellulär immunfluorescens, immunfällning och besläktade analyser. Denna metod kommer att accelerera antikropps upptäckt och slutligen föra oss närmare att förverkliga målet of generera förnybar, högkvalitativa antikroppar mot proteomet.
Introduction
Med uppkomsten av efteriska åldern är viktigt att det finns bindande reagens högkvalitativa att karakterisera och modulera proteiner för att öppna ny forskning och terapeutiska avenyer. Antikroppar fortsätter att vara avgörande för både akademiska och industriella forskare som grundforskning och diagnostiska verktyg och potentiella läkemedel. Inte överraskande, har det skett en imponerande tillväxt på kontraktsantikropps utveckling företag, varav de flesta förlitar sig på konventionella hybridoma teknik för att generera egna antikroppar. Ändå är in vitro val med faguppvisade antikroppsbibliotek bli ett kraftfullt alternativ teknik som kan erbjuda unika fördelar och framgångar där konventionell teknik kan möta begränsningar 1, 2.
Mot bakgrund av den stora efterfrågan på högkvalitativa antikroppar som forskningsverktyg, två primära utmaningar för att generera förnybar antikroppar är 1) val genomströmning och 2) antigen AVtillgång-. Ett antal grupper har nu beskrivits i vitro urvalsledningar som syftar till att öka genomströmningen och hastigheten för identifierings antikropp. Dessa beskrivningar detalj en mängd livskraftiga metoder som inkluderar att välja på antingen fullängds riktar 3,4, eller strukturellt relaterade domäner 5,6,7, antingen pärla baserade 6,8 eller plattbaserade 3,4 antigen immobilisering system. Dessutom har den ökande införandet av gensyntes teknik 9 systematiseras antigen generation, särskilt av isolerade domäner, rimligen kostnadseffektivt och kan potentiellt minska svårigheten att få tillräckliga mängder av renat, hellång antigen. Genom att använda de två teknikerna i tandem, var ett fristående och skalbar antigengenerering och urval antikropps pipeline utarbetas som möjliggör parallell isolering av antikroppar för stora uppsättningar uttryckta antigen domäner och underlätta utvecklingen av reagens för characterizing hela klasser av strukturellt eller funktionellt relaterade proteiner.
Mot detta mål, en integrerad pipeline som par i silico identifiera uttryckantigendomäner, gen syntes, hög genomströmning bakteriell uttryck av antigener och skalbara faguppvisade val antikropps har utvecklats. Denna pipeline kräver endast grundläggande infrastruktur tillgänglig för de flesta life science laboratorier (inklusive antikroppsbibliotek som blir allt tillgängligt via licens eller materialöverlåtelseavtal), men är också mottaglig för automatisering för användning i industriell skala. Med hjälp av detta protokoll, är det möjligt att generera hundratals affinitets taggade antigendomäner, och rutinmässigt isolera mycket specifika antikroppsfragment till många av dessa antigener.
Fag display teknik har visat visat kompatibilitet med ett brett utbud av rekombinanta affinitet reagens format inklusive Fab, scFv, och autonoma Fv-domäner ochväxande utbud av små "alternativa ramar" (designade ankyrin upprepningsproteiner (DARPINS), fibronektin (FN), lipokalin domäner och mer 10). Diskussionen är begränsad i detta exempel till isoleringen av Fab-antikroppsfragment, även om det förutsätts att dessa metoder kan anpassas till andra typer av bibliotek. Med hjälp av denna teknik, Fabs med låg nanomolär affinitet till små, taggade proteindomäner inklusive transkriptionsfaktordomäner, SH2 domäner, RNA-bindande proteiner och andra har framgångsrikt utvalda, av vilka många binder fullängds protein och är funktionella i immun såsom immunofluorescens , immunoutfällning och immunohistokemi. Viktigt rekombinanta bindande kloner är helt förnybart och kan åter genereras från uttryckskonstruktioner via bakteriell produktion erbjudande ökad enhetlighet, reproducerbarhet och kostnadseffektivitet, vilket motiverar bekostnad av rigorös klon validering.
I denna protocol och medföljande video, är grundläggande metoder för val av antikropp från faguppvisade bibliotek använder immobiliserade antigendomäner demonstreras. Denna speciella metod använder GST-märkt proteindomäner immobiliserade genom passiv adsorption i mikrobrunnplattor, även om andra taggar 11,12,13 och selekteringsformat 13,14,2 har också använts med framgång. Kritiska överväganden för installation och genomförande av val med parallella övervakning av urvalsparametrar som syftar till att identifiera och isolera specifikt berikade klon antikroppar för validering är detaljerade.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vid genomförande in vitro val antikropps, de två primära faktorerna för val framgång är 1) isolering av väl vikta antigena mål för val på och 2) att det finns en hög funktionell mångfald antikroppsbibliotek. I många fall kan begränsa tillgången på tillräckliga mängder av väl vikta, fullängdsproteinet. Ett tillvägagångssätt för att övervinna denna begränsning är att använda domäner identifierats från bioinformatikanalys 22 och syntetiserade för insättning i en bakteriel…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka för NIH gemensamma fonden – Protein Fånga Reagens Program för att finansiera utvecklingen av rekombinant antikropp Val antikropp och karakterisering pipeline och den kanadensiska Stiftelsen för Innovation för finansiering köp av roboturvalsplattform.
Materials
| MATERIALS | |||
| Name | Company | Catalog Number | |
| New Brunswick Innova44 stackable incubator shaker | Eppendorf | M1282-0004 | |
| Liquidator 96 channel manual benchtop pipetting system | Anachem Ltd | LIQ-96-200 | |
| Microplate shaker | VWR | 12620-926 | |
| ThermoScientific Sorvall ST-40 benchtop centrifuge | Thermo Product | 75004525 | |
| ELx405 Select Deep Well Microplate Washer | Biotek | ELX405USD | |
| Custom High Throughput Automated Phage Selection Robot | S&P Robotics | ||
| Plastic conical Falcon tube: 50 mL | VWR | 21008-178 | |
| Plastic conical Falcon tube: 15 mL | VWR | 89039-668 | |
| Axygen 1.7 mL microcentrifuge tubes | Corning | MCT-175-L-C | |
| 96-well/384-well Maxisorp plate | Sigma | M9410-1CS | |
| Corning 96-well V-bottom deep-well block | Corning | 3960 | |
| Axygen Mini-tube 96-well sterile microplate blue box | Corning | AXY-MTS-06-C-R-S | |
| Breathable adhesive plate sealing film | VWR | 60941-084 | |
| REAGENTS | |||
| Name | Company | Catalog Number | |
| polyethylene glycol | Bioshop | PEG800.1 | |
| yeast extract | Bioshop | YEX401.1 | |
| bio-tryptone | Bioshop | TRP402.1 | |
| N-Z amine | Sigma | C7290 | |
| glucose | Sigma | G8270-1KG | |
| lactose | Bioshop | LAC234 | |
| glycerol | Bioshop | GLY001.500 | |
| carbenicillin | Bioshop | CAR544.10 | |
| kanamycin | Bioshop | KAN201.25 | |
| tetracycline | Bioshop | TET701.25 | |
| Tween 20 | Bioshop | TWN510.500 | |
| monobasic potassium phophate | Bioshop | PPM302.1 | |
| dibasic sodium phosphate | Anachemia | 84486-440 | |
| sodium chloride | Bioshop | SOD001.10 | |
| potassium chloride | Bioshop | POC308.1 | |
| calcium chloride | Bioshop | CCL302.500 | |
| magnesium sulphate | EMD | MX0070-1 | |
| magnesium chloride | Bioshop | MAG510.500 | |
| NH4Cl | Amresco | 0621-1KG | |
| Na2SO4 | Bioshop | SOS513.500 | |
| agar | Bioshop | AGR001.500 | |
| SybrSafe DNA gel stain | Invitrogen | S33102 | |
| phosphoric acid | Acros Organics | 201140010 | |
| lysozyme | Bioshop | LYS702.25 | |
| benzonase | Novagen | 71205 | |
| Triton X-100 | Bioshop | TRX506.500 | |
| protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 11 836 170 001 | |
| Ni-NTA resin | Qiagen | 1018240 | |
| 1000x helper phage (M13K07) stock (1013 phage per mL) | NEB | N0315S | |
| HRP conjugated M13-specific antibody (anti-M13-HRP). | GE Healthcare | 27-9241-01 | |
| TMB substrate: mix equal volumes of TMB and H2O2 peroxidase substrate | KPL | 50-76-00 | |
| dNTPs | Biobasic | DD0056 | |
| Taq polymerase | Genscript | E00007 | |
| Exonuclease | GE Healthcare | EZ0073X-EZ | |
| Shrimp alkaline phosphatase | GE Healthcare | E70092Z-EZ | |
Referências
- Winter, G., Milstein, C. Man-made antibodies. Nature. 349, 293-299 (1991).
- Miersch, S., Sidhu, S. S. Synthetic antibodies: concepts, potential and practical considerations. Methods. 57, 486-498 (2012).
- Schofield, D. J., et al. Application of phage display to high throughput antibody generation and characterization. Genome Biol. 8, R254 (2007).
- Hust, M., et al. A human scFv antibody generation pipeline for proteome research. J. Biotechnol. 152, 159-170 (2011).
- Colwill, K., Graslund, S. A roadmap to generate renewable protein binders to the human proteome. Nat. Methods. 8, 551-558 (2011).
- Mersmann, M., et al. Towards proteome scale antibody selections using phage display. Nat. Biotechnol. 27, 118-128 (2010).
- Pershad, K., et al. Generating a panel of highly specific antibodies to 20 human SH2 domains by phage display. Protein Eng. Des. Sel. 23, 279-288 (2010).
- Turunen, L., Takkinen, K., Soderlund, H., Pulli, T. Automated panning and screening procedure on microplates for antibody generation from phage display libraries. J Biomol. Screen. 14, 282-293 (2009).
- Hughes, R. A., Miklos, A. E., Ellington, A. D. Gene synthesis: methods and applications. Methods Enzymol. 498, 277-309 (2011).
- Boersma, Y. L., Pluckthun, A. DARPins and other repeat protein scaffolds: advances in engineering and applications. 22, 849-857 (2011).
- Terpe, K. Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl. Microbiol. Biotechnol. 60, 523-533 (2003).
- Lichty, J. J., Malecki, J. L., Agnew, H. D., Michelson-Horowitz, D. J., Tan, S. Comparison of affinity tags for protein purification. Protein Expr. Purif. 41, 98-105 (2005).
- Fellouse, F. A., et al. High-throughput generation of synthetic antibodies from highly functional minimalist phage-displayed libraries. J. Mol. Biol. 373, 924-940 (2007).
- Paduch, M., et al. Generating conformation-specific synthetic antibodies to trap proteins in selected functional states. Methods. 60, 3-14 (2013).
- Studier, F. W. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Protein Expr. Purif. 41, 207-234 (2005).
- Huang, H., Sidhu, S. S. Studying binding specificities of peptide recognition modules by high-throughput phage display selections. Methods Mol. Biol. 781, 87-97 (2011).
- McLaughlin, M. E., Sidhu, S. S. Engineering and analysis of peptide-recognition domain specificities by phage display and deep Sequencing. Methods Enzymol. 523, 327-349 (2013).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
- den Engelsman, J., et al. Strategies for the assessment of protein aggregates in pharmaceutical biotech product development. Pharm. Res. 28, 920-933 (2011).
- Lavinder, J. J., Hari, S. B., Sullivan, B. J., Magliery, T. J. High-throughput thermal scanning: a general, rapid dye-binding thermal shift screen for protein engineering. J. Am. Chem. Soc. 131, 3794-3795 (2009).
- Fellouse, F. A., Sidhu, S. S., Howard, G. C., MR, K. a. s. e. r. . Making antibodies in bacteria. in Making and Using Antibodies: A Practical Handbook. , 151-172 (2013).
- Acton, T. B., et al. Preparation of protein samples for NMR structure, function, and small-molecule screening studies. Methods in Enzymology. 483, 23-47 (2011).
- Mahon, C. M., et al. Comprehensive interrogation of a minimalist synthetic CDR-H3 library and its ability to generate antibodies with therapeutic potential. J. Mol. Biol. 425, 1712-1730 (2013).
- Persson, H., et al. CDR-H3 diversity is not required for antigen recognition by synthetic antibodies. J. Mol. Biol. 425, 803-811 (2013).
- Bradbury, A. R., Sidhu, S., Dubel, S., McCafferty, J. Beyond natural antibodies: the power of in vitro display technologies. Nat. Biotechnol. 29, 245-254 (2011).
