Magnetiska pincett, en kraftfull enda molekyl manipulation teknik, kan anpassas för direkta mätningar av twist (med en konfiguration som kallas fri-orbiting magnetiska pincett) och vridmoment (med en konfiguration kallas magnetiskt moment pincett) i biologiska makromolekyler. Riktlinjer för utförande av sådana mätningar ges, inklusive ansökningar till studier av DNA och tillhörande nucleo-protein trådar.
Enda molekyl tekniker gör det möjligt att undersöka hur enskilda biologiska molekyler i lösning i realtid. Dessa tekniker inkluderar sk force spektroskopi metoder såsom atomkraftsmikroskopi, optisk pincett, flöde stretching och magnetiska pincett. Bland dessa metoder, har magnetiska pincett utmärkt sig genom sin förmåga att tillämpa vridmoment samtidigt som en konstant stretching kraft. Här är det illustrerat hur en sådan "konventionella" magnetiska pincett experimentella konfigurationen kan genom en enkel modifiering av dess fältkonfigurationen för att minimera storleken på den transversella fält, vara anpassad för att mäta graden av vridning i en biologisk molekyl. Den resulterande konfigurationen kallas de fritt-kretsar runt magnetiska pincett. Dessutom är det visat hur ytterligare modifiering av fältkonfigurationen kan ge en tvärgående fält med en storlek mellan den för den & #8220; konventionella "magnetiska pincett och de fritt-orbiting magnetiska pincett, vilket gör det möjligt att direkt mäta det vridmoment som finns lagrad i en biologisk molekyl. Denna konfiguration kallas de magnetiska moment pincett. Den medföljande video förklarar i detalj hur omvandlingen av konventionella magnetiska pincett i fritt-kretsande magnetiska pincett och magnetiska moment pincett kan åstadkommas, och visar användningen av dessa tekniker. Dessa anpassningar behålla alla styrkor av konventionella magnetiska pincett samtidigt kraftigt utöka mångsidigheten hos denna kraftfulla instrument.
Under senare år har enda molekyl tekniker bevisat deras breda tillämplighet i studien av processive motorproteiner och andra enzymer, vilket ger inblick i deras kinetik och den underliggande mechanochemistry. I samband med kraft spektroskopi, har viktiga insatser gjorts av atomkraftsmikroskopi flöde stretching, och optiska och magnetiska pincett. Optiska och magnetiska pincett (MT) har bland annat lyckats kombinera stor flexibilitet i fråga om molekylär manipulation med hög rumslig och tidsmässig upplösning. Här fokuserar vi på MT, som kan gälla både stretching krafter och moment till biologiska molekyler bundna mellan en yta och superparamagnetiska kulor 1-3.
Magnetiska pincett (MT, figur 1a) är en mycket mångsidig enda molekyl teknik som har använts för att övervaka både de mekaniska egenskaperna hos nukleinsyror och deras interaktioner med proteiner. MT har många styrkas, inklusive total enkelhet och robusthet i den experimentella genomförande, facile tillämpning av vridmoment, naturlig drift och enkel kalibrering i konstant kraft läge 4, förlängning till parallella mätningar 5, 6, och frånvaro av prov värme och fotoskador. Jämfört med andra enda molekyl närmar sig, MT ger ett sätt att utföra tvångsberoende mätningar vid krafter så låga som ≈ 10 FN och har förmågan att rakt kontrollera graden av supercoiling. Medan MTs har övervägande använts som ett experimentellt verktyg för att undersöka biologiska processer som involverar nukleinsyror 7, 8, har de också funnit användning i studier av de mekaniska egenskaperna hos proteiner 9-13 eller celler 10, 14-17. Många användbara referenser finns som beskriver hur man bygger och driver en MT 4, 18-20.
However, gör konventionell MT inte spåra roterande rörelsen direkt, och, medan de gäller vridmoment, de inte mäter vridmoment direkt. Dessutom är de begränsa den fria rotationen av nukleinsyran tjuder. Här presenterar vi två förlängningar av magnet pincett. De första, benämnda fritt-orbiting magnetiska pincett (FOMT, figur 1b) 21, tillåter mätningar av jämviktsvinkelvariationer och förändringar i snodd av tjudrade nukleinsyramolekyler, utan begränsande rotationsrörelse runt tjuder axeln. Den andra, benämnd magnetiska moment pincett (MTT, figur 1c), som har förmågan att tillämpa och direkt mäta både krafter och moment till enskilda biomolekyler 22-27.
I följande protokoll, vi förutsätter att läsaren har på hans / hennes disposition en "konventionell" MT instrument. Vi hänvisar läsaren till den diskussion om referenser om hur man bygger och driver en MT inrättas, liksom consideransoner som måste tas i beaktande vid val av magnetiska pärlor, magneter och spårningsrutiner. Dessutom, avsnitt 1 och 2 i protokollet text beskriver hur vi vanligtvis förbereder och inkubera ett DNA-prov för användning i MT samt de preliminära mätningar som kan utföras på en enda DNA i den konventionella MT. § § 3 och 4 i protokollet Text illustrera hur ett MT instrument kan lätt anpassas och användas för FOMT och MTT mätningar.
När du kör experiment med hjälp av MTT eller FOMT, ett antal val måste göras om pärlor, magneter, spårning protokoll etc. De bästa val som ska göras kommer att bero på försöket av intresse. Nedan beskriver vi de avvägningar som följer med olika val, vilket bör underlätta valet för ett visst experiment. Därefter beskriver vi flera viktiga steg som följer inriktningen och driften av MTT och FOMT experiment. Slutligen diskuterar vi betydelsen av MTT och FOMT med avseende på befintliga metoder och framtida tillämpningar.
Överväganden före starten av MTT och FOMT Experiment
Varje experiment kräver en att välja en typ av magnetisk pärla för användning. Man kan välja mellan flera kommersiellt tillgängliga streptavidintäckta superparamagnetiska kulor, till exempel, 0,25 um radie pärlor, 0,5 ìm radie pärlor, eller 1,4 ìm radie pärlor (see tabellen Materials). Större pärlor kommer att ha en ökad magnetiskt moment jämfört med mindre pärlor (grovt skalnings eftersom volymen) och därmed deras användning kommer att underlätta tillämpningen av högre krafter (för typiska krafter som uppnås i våra instrument, se tabell 1). När vinkel spårning med hjälp av markör pärlor önskas, vi arbetar vanligtvis med 1,4 ìm radie och använda 0.5 um radie omagnetiska biotinylerade pärlor som markör pärlor (se punkt 1.9 för motsvarande fäst-protokollet). Användningen av mindre pärlor rekommenderas speciellt för FOMT, som det karakteristiska tidsplanen för pärla rotation τ C är lika med kvoten mellan systemets dra över sin fjäderkonstanten γ / k θ; viktigare, rotationsluftmotståndskoefficient är relevant för de vinkel mättid skala skalor som ~ R vulst 3, dvs med den tredje potensen av radien (se tabell 2 förden karakteristiska tidsskalor för flera pärla-DNA-kombinationer i FOMT och MTT mätningar). Kompletterande minskningar av den största kraft som kan tillämpas kan åtgärdas med hjälp av en spegelvänd bunt med cylindriska magneter 27. Icke desto mindre i FOMT mätningar det ibland kan vara nödvändigt att kompromissa mellan det bästa möjliga tidsmässiga upplösningen och den maximala anbringade kraften.
Dessutom kräver ett experiment valet av en magnet-konfiguration. I den konventionella magnetiska pincett konfiguration (Figur 1a), använder vi oftast ett par 5x5x5 mm cubic magneter i vertikalt läge med en 0,5 eller 1 mm mellan magneterna 4. När magneterna är placerade på avstånd längs x axeln (y), ger detta ett magnetfält som i huvudsak är riktad längs med x (y) axel. För FOMT experiment används en cylindriskt formad magnet vald vid vars centrum magnetfältet är primärt inriktadutmed z-axeln (figur 1b). I praktiken använder vi en stapel av tre sådana cylindriskt formade magneter, var och en med en diameter av 6 mm och en 2 mm diameter centralt hål, till en total tjocklek av 6 mm. Vid högre dragkrafter är önskvärda, är en "spegelvänd stack" magnet konfiguration i vilken den nedre magneten är staplad med motsatt magnetisering föredragna. För att uppnå den MTT-konfiguration (Fig. 1c), vi lägga till ytterligare en magnet till sidan av huvudmagneten stacken hos FOMT konfiguration, vanligtvis en solid cylinder med 4 mm diameter och en höjd av 7 mm. För att se hur de maximala krafter som uppnåtts i våra instrument är beroende av magnetkonfigurationen, se tabell 1.
Anpassningen av MTT och FOMT Experiment
Eftersom magnetiska kulor har en (ungefär) jämnt funktion yta (vanligtvis streptavidin) och sedan fastsättning av både den funktion nucleic sura tjuder och markör pärlor (ifall markören pärla baserade vinkel tracking används) sker via enkel inkubation i lösning, behöver man inte styra var de tjuder och / eller markör pärla fäster vid magnetisk pärla. De magnetiska pärlorna har en föredragen magnetiseringsriktning axel som tenderar att rikta in längs riktningen av det yttre fältet. Om vi betecknar de punkter där den föredrog magnetisering axeln skär pärlan yta som de nord-och sydpolen, då kulor där DNA-tjuder är fäst nära ekvatorn kommer att spåra ut en rund ring med en radie nära eller något större än vulst radie i FOMT; däremot kommer pärlor som är fästa nära sydpolen fluktuera på en rund ring med mycket liten radie i FOMT, vilket kan hindra montering av cirkeln med hjälp av ekvationerna 3-5. Vi noterar att med enkel sfärisk geometri, är sannolikheten för att fästa nära ekvatorn mycket större än en bifogad fil precis vid polerna; alltså, de flesta bEADS kommer att vara uppbundna sådan att (x, y)-baserad vinkelspårning kan genomföras framgångsrikt.
Ett liknande argument gäller för fastsättning av markör pärlor för referensmarkören baserad vinkel spårning. Markören pärla används för att skapa en asymmetri i bilden av den magnetiska pärla som gör att vinkelspårning. Om markören pärla är fäst precis vid norra eller södra polen på pärlan (dvs. direkt på toppen eller på botten), är den resulterande bilden fortfarande rotationssymmetrisk och vinkelspårningsprotokollet misslyckas. Men av samma sfäriska geometri argument, är chansen för en markör pärla att fästa direkt på en av polerna relativt liten; finner vi att i praktiken de flesta markör pärlor ger en tillräcklig asymmetri för att möjliggöra vinkelspårning. Slutligen kan vi konstatera att i de konventionella magnetiska pincett fältet riktningen är i (x, y)-planet; därför kommer de föredragna magnetisering axel vulsten rikta in the (x, y)-planet och de nord-och sydpolen, enligt definitionen ovan, kommer att vara på sidorna av pärlan, osannolika situationen i FOMT eller MTT, där polerna är på toppen och botten.
I FOMT experiment, är ett kritiskt steg i anpassningen av den cylindriska magneten, så att det radiella magnetfältet är försumbar i närhet till pärlan. Denna anpassning utförs för en enstaka kula i taget. För att bedöma om pärla rörelse i FOMT är jämnt fördelad på en cirkulär ring, bör mätningstiden överstiga 20 · τ C. Eftersom τ C motsvarar ~ 45 sek för 8 kb DNA och en 0,5 mm radie pärla, är tidsmätningen ~ 900 sek i slutskedet av anpassning. Som jämförelse, användning av 1,9 kb DNA och 0,25 mm radie pärlor reducerar τ C tjugo gånger till ~ 2 sek (se även tabell 2).
Kritiska moment och Överväganden för spårning under FOMT och MTT Experiment
För att spåra bead s i planet fluktuationer, dvs sin (x, y)-positionen, använder vi en korskorrelationsanalys av intensitetsprofiler som visas av en vulst vid efterföljande tidsintervall 35, 36. Detta kan utföras vid delpixel upplösning med en noggrannhet av några få nanometer 20. Om du vill spåra pärlan rörelse i z, använder vi oftast en metod som först designad av Gosse och Croquette, där målet är fokalplan (OFP) är korrekt flyttas i vertikal riktning medan avbildning diffraktion ringar pärlan bifogas nukleinsyra 20 . På detta sätt är en kalibreringsprofil genererad korrelering diffraktionsmönstret av vulsten till avståndet mellan vulsten och OFP 19. När denna kalibreringsprofil interpoleras, kan de vertikala förskjutningar av fogen även mätas med en noggrannhet på upp till några nm 20.Vi hänvisar läsaren till ytterligare referenser som beskriver mer förfinade spårningsalgoritmer 37, 38 samt deras tillämpning på parallell spårning av flera kulor 5, 6, 37.
Vid användning av vinkelspårning som är beroende av omvandlingen av (x, y)-positioner i kantiga koordinater, rekommenderar vi att gör så här. Från en tidskurva där pärlan spårar ut en rund ring, använder du (x, yi) positioner (där index i betecknar efterföljande mätpunkter) för att passa cirkelcentrum (x 0, y 0) och radien R cirkel (figur 2a) genom att minimera:
(3)
där summan löper över alla datapunkter. Efter fitting x 0, y 0, och R cirkel, bestämma polära koordinater (r jag, θ i) för varje datapunkt i tidskurva med hjälp av:
(4)
(5)
Observera att man bör vara noga med att "packa upp" vinkeln θ, dvs att lägga fas hoppar av ± π där så är lämpligt. Custom-skriven kod för montering och konvertering från (x, y) till (r, θ) koordinater är tillgänglig från författarna på begäran. I FOMT kan en tidskurva i vilken vulsten spårar ut en cirkulär ring erhållas genom att åstadkomma grovinriktning (jfr steg 3,3) och registrering av termiska fluktuationer av pärlan. I MTT, termisk fluksamheten är otillräckliga för att spåra ur den runda ringen; Använd i stället en tidskurva där magneterna är långsamt (vanligen vid 0,1 Hz) roteras några varv för att passa cirkeln med hjälp av ekvationerna 3-5.
Vi noterar att för MTT, är det viktigt att välja rätt vinkel tracking metod, det vill säga via en vinkelspårnings markör (Figur 1c Figur 1d, figur 3a) eller genom omvandling av (x, y)-positioner i kantiga koordinater ( Figur 1d, figur 2b). Medan vanligtvis noggrannhet vinkel spårning från (x, y)-positioner och användning av markör pärlor är jämförbara, är det viktigt att inse att överhörning sker mellan en pärla s fluktuationer i (x, y) och i vinkel, enligt beskrivningen i Janssen et al 32: alltså, gäller endast vinkel spårning från (x, y)-ståndpunkter, under förutsättning att de Brownsk fluktuationer i (x, Y) bidrar endast obetydligt av osäkerheten i vinkel samordna, och dess rätta användning av (x, kan y)-spårning kräver inställning av rotations fällan stelhet genom justering av positionen för sidomagneten. Typiskt kan användningen av högre fälla styvhet kräver användning av vinkelspårning med användning av markörpärlor. Användning av märk pärlor kräver en extra fäststeg, vilket kan minska antalet användbara tjuder (se den bifogade protokollet i steg 1.9). Vid användning av markerings vulsten baserade spårningssystem, är det viktigt att välja magnetiska pärlor som har en markör vulsten är fäst nära ekvatorn för bästa resultat.
Betydelsen av FOMT och MTT Approaches jämfört med existerande metoder och tillämpningar
I det ovanstående har vi visat hur en kan, utgående från konventionell MT, enkelt ändra magnet konfigurationer för att konvertera instrumentet till MTT eller FOMT. Denna okomplicerade mNDRING, vilket kan åtföljas av införandet av vinkelspårning när användningen av en vinkelspårningsmarkör önskas, är en omedelbar styrka i båda lägena, eftersom det tillåter användaren att tillämpa vridmoment, mäta vridmoment, eller mäta twist beroende på experimentera till hands. Som nämnts i inledningen, både FOMT och MTT nytta av många av de befintliga styrkorna i MT, särskilt deras enkelhet, med MTT särskilt gynnas också förmågan av parallella mätningar 5, 6 (dessa är inte så lätt att uppnå i FOMT givet kravet på inriktning av tjuder med avseende på mitten av den cylindriska magneten). Noterbart MTT och FOMT kräver inte, i motsats till andra tekniker, speciellt nanotillverkade partiklar 22, 39, 40, komplex optisk design 41, eller införande av ytterligare pärlor inom den bundna (DNA)-molekyl 42. Sådan ovriga metoder kan dock ge andra fördelar såsom högre tidsupplösning 27, 43, 44. Både FOMT och MTT bör finna framtida tillämpningar inom studiet av genomet behandling, eftersom beteendet hos molekylära motorer på DNA är både påverkas av och får konsekvenser för den lokala twist och vridmoment. Ytterligare program finns i det framväxande området DNA nanoteknik 27 eller i den bredare roterande motorer verksamma inom biologisk behandling 7, 45.
M270 (R pärla = 1,4 mikrometer) | MyOne (R pärla = 0,5 mikrometer) | Ademtech (R vulst = 0,25 | im) | |
Konventionell MT (par kubik 5 x 5 x 5 mm 3 magneter, 1 mm gap, vertical alignment) | 70 pN | 8 pN | 1,6 pN |
FOMT eller MTT * (stapel av tre cylindriska magneter, 6 mm diameter, 2 gap mm diameter) | 9 pN | 1 pN | 0,2 pN |
FOMT eller MTT * (stapel av tre cylindriska magneter, 6 mm i diameter, ett gap mm diameter) | 18 pN | 2 pN | 0,4 pN |
FOMT eller MTT * (stapel med tre cylindriska magneter med senaste vänt, spalt 1 mm diameter) | ~ 50 pN | 9 pN | 1,8 pN |
* Förekomst av den lilla sidan magneten i MTT har en försumbar effekt på sträckkraften
Tabell 1. Maximala krafter normalt uppnås för olika magnetkonfigurationer och pärla typer.
R vulst = 1,4 | im | R pärla = 0,5 nm | R vulst =0,25 | im | |
Friktionskoefficient * | 120 pN · nm · sec | 5.5 PN · nm · sec | 0.7 PN · nm · sec |
Karakteristiskt tidsskala: FOMT, 10 kb DNA ** | 1200 sek | 55 sek | 7 sek |
Karakteristiskt tidsskala: FOMT, 1 kb DNA | 120 sek | 5,5 sek | 0,7 sek |
Karakteristiskt tidsskala: MTT, k q = 100 PN · nm / rad | 1,2 sek | 0,06 sek | 0,007 sek |
Karakteristiskt tidsskala: MTT, k q = 1000 pN · nm / rad | 0,12 sek | 0,006 sek = 6 ms | 0,0007 s = 0,7 ms |
* Friktionskoefficient för rotation kring en axel som går genom "ekvator" (det vill säga den situation som visas i figur 1b), Som ges av 14 • p * h * R vulst 3, där h är viskositeten i bufferten.
** I FOMT är rotations fälla styvhet ges av vridstyvheten hos DNA, k q, DNA = C • k B T / L C, där C är den effektiva vrid persistens längd, antas vara 80 nm here ( som är karakteristisk för en mellanliggande kraftordning, F ~ 1 PN) och L C är konturlängd av DNA, 0,34 nm per baspar.
Tabell 2. Friktions koefficienter och karakteristiska tidsskalor för FOMT och MTT.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av TU Delft, Nederländerna Organisationen för vetenskaplig forskning (NWO), Stiftelsen för grundläggande forskning om materia, och av Europeiska vetenskapsstiftelsen.
Sandblaster | Great Lake Orthodontics | 190-070 Microetcher II | |
Nitrocellulose | Life Technologies | LC2001 | |
Magnetic particle concentrator | Life Technologies | 12002D | |
Non-magnetic latex beads (0.5 μm radius) | Polysciences | 17010 | |
Non-magnetic latex beads (1.5 μm radius) | Sanbio | PV05N/2179 | |
Antidigoxigenin | Roche | 11 214 667 001 | |
Streptavidin-coated superparamagnetic beads (0.25 μm radius) | Ademtech | 3150 | |
Streptavidin-coated superparamagnetic beads (0.5 μm radius, “MyOne”) | Life Technologies | 650.01 | |
Streptavidin-coated superparamagnetic beads (1.4 μm radius, “M270”) | Life Technologies | 653.05 | |
Biotin-coated latex beads (0.5 μm radius) | Life Technologies | F-8768 | |
Cubic magnets for conventional tweezers | Supermagnete | W-05-N50-G | |
Cylindrical magnet for MTT and FOMT | Supermagnete | R-06-02-02G | |
Side magnet for MTT | Supermagnete | S-04-07-N | |
Linear stage | Physik Instrumente | M-126.PD | |
Rotary stage | Physik Instrumente | C-150 | |
High-resolution automated sample stage | Physik Instrumente | P-733.2D | |
Software for coding analysis routines | The Mathworks | Matlab | custom-written routines are available from the authors |