שני פוטונים<em> In vivo</em> הדמיה של קוצים הדנדריטים בCortex העכבר באמצעות דלילה, גולגולת הכנה
Summary
Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.
Abstract
בקליפת המוח של היונקים, תאי עצב יוצרים רשתות מאוד מסובכות ולהחליף מידע בסינפסות. שינויים בחוזק סינפטי, כמו גם תוספת / הסרה של סינפסות, מתרחשים באופן חוויה תלויה, המספקים את היסוד המבני של פלסטיות עצבית. כרכיבי postsynaptic של סינפסות המעוררות ביותר בקליפת המוח, קוצים הדנדריטים נחשבים פרוקסי טוב של סינפסות. יתרונות לוקחים גנטיקה עכבר וטכניקות תיוג פלורסנט, נוירונים בודדים והמבנים הסינפטי שלהם יכולים להיות מתויגים במוח שלם. כאן אנו מציגים פרוטוקול הדמיה transcranial באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר שני פוטונים לעקוב קוצים שכותרתו fluorescently postsynaptic הדנדריטים לאורך זמן in vivo. פרוטוקול זה משתמש בהכנה דלילה, גולגולת, אשר משומרת על הגולגולת שלמה ותמנע תופעות דלקתיות הנגרמות על ידי חשיפה של קרומי המוח וקליפת המוח. לכן, ניתן לרכוש תמונות מייד לאחר surgery מתבצע. הליך הניסוי ניתן לבצע שוב ושוב על פני מרווחי זמן שונים, החל משעות לשנים. היישום של הכנה זו גם ניתן להרחיב כדי לחקור אזורים שונים בקליפת המוח ושכבות, כמו גם סוגי תאים אחרים, בתנאים פיסיולוגיים ופתולוגיים.
Introduction
היונקים הקליפה משתתפת בתפקודי מוח רבים, משליטת תפיסה והתנועה חושית לעיבוד מידע מופשט וקוגניציה. פונקציות שונות בקליפת המוח לבנות על מעגלים עצביים שונים, אשר מורכבים סוגים שונים של נוירונים תקשורת והחלפת מידע בסינפסות בודדות של. המבנה והתפקוד של סינפסות באופן עקבי להיות שונה בתגובה לחוויות ופתולוגיות. במוח הבוגר, פלסטיות הסינפטית לובשת צורה של שני שינויי כוח ובנוסף / הסרה של סינפסות, ממלאת תפקידים חשובים ביצירת ותחזוקה של מעגלים עצביים פונקציונליים. קוצים הדנדריטים הם רכיבי postsynaptic של רוב סינפסות מעוררות במוח של היונקים. התחלופה המתמדת ושינויים מורפולוגיים של קוצים הם האמינו לשמש אינדיקטור טוב של שינויים בקשרים סינפטיים 1-7.
מיקרו לייזר סריקת שני פוטוניםscopy מציע חדירה עמוקה דרך, הכנות אטומות עבות וphototoxicity הנמוך, מה שהופך אותו מתאים להדמיה לחיות במוח שלם 8. בשילוב עם תיוג פלורסנט, שני פוטונים הדמיה מספקת כלי רב עוצמה כדי להציץ לתוך המוח החי ופעל לארגון מחדש מבני בסינפסות בודדות עם גבוה במרחב וברזולוציה של זמן. שיטות שונות שימשו להכנת עכברי הדמיה לחיות 9-13. כאן, אנו מתארים הכנה דלילה, גולגולת של in vivo שני פוטונים הדמיה כדי לחקור את הפלסטיות המבנית של קוצים הדנדריטים postsynaptic בקליפת מוח העכבר. שימוש בגישה זו, המחקרים האחרונים שלנו תיארו תמונה דינמית של שינויים בעמוד השדרה הדנדריטים בתגובה למיומנות מוטורית לומדת עם זמינות גוברת של בעלי חיים מהונדסים עם תת נוירונים שכותרתו fluorescently והתפתחות מהירה של in vivo טכניקות תיוג, יכולים להיות מיושמים גם נהלים דומים שתוארו כאן לחקירהסוגי te תאים אחרים ואזורים בקליפת המוח, בשילוב עם מניפולציות אחרות, כמו גם בשימוש במודלים של מחלת 16-23.
Protocol
Representative Results
Discussion
כדי להשיג הכנה דלילה, גולגולת מוצלחת, כמה צעדים בפרוטוקול זה הם קריטיים. 1) העובי של הגולגולת. יש עצם גולגולת מבנה כריך, עם שתי שכבות של עצם קומפקטי בצפיפות גבוהה ושכבה אמצעית של עצם ספוגי בצפיפות נמוכה. בעוד תרגיל מיקרו במהירות גבוהה הוא מתאים להסרת השכבות החיצוניות ש?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לג'יימס Perna להמחשה הגרפית. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכון הלאומי לבריאות הנפש לYZ
Materials
| Ketamine | Bioniche Pharma | 67457-034-10 | Mixed with xylazine for anesthesia |
| Xylazine | Lloyd laboratories | 139-236 | Mixed with ketamine for anesthesia |
| Saline | Hospira | 0409-7983-09 | 0.9% NaCl for injection and imaging |
| Razor blades | Electron microscopy sciences | 72000 | Double-edge stainless steel razor blades |
| Alcohol pads | Fisher Scientific | 06-669-62 | Sterile alcohol prep pads |
| Eye ointment | Henry Schein | 102-9470 | Petrolatum ophthalmic ointment sterile ocular lubricant |
| High-speed micro drill | Fine Science Tools | 18000-17 | The high-speed micro drill is suitable for thinning the outer layer of compact bone and targeting a small area |
| Micro drill steel burrs | Fine Science Tools | 19007-14 | 1.4 mm diameter |
| Microsurgical blade | Surgistar | 6961 | The microsurgical blade is suitable for thinning the inner layer of compact bone and middler layer of spongy bone |
| Cyanoacrylate glue | Fisher Scientific | NC9062131 | Fix the head plate onto the skull |
| Suture | Havard Apparatus | 510461 | Non-absorbale, sterile silk suture, 6-0 monofilament |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ61 | |
| CCD camera | Infinity | ||
| Two-photon microscope | Prairie Technologies | Ultima IV | |
| 10X objective | Olympus | NA 0.30, air | |
| 60X objective | Olympus | NA 1.1, IR permeable, water immersion | |
| Ti-sapphire laser | Spectra-Physics | Mai Tai HP |
Referências
- Holtmaat, A., Svoboda, K. Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain. Nature reviews. Neuroscience. 10, 647-658 (2009).
- Fu, M., Zuo, Y. Experience-dependent structural plasticity in the cortex. Trends in neurosciences. 34, 177-187 (2011).
- Yu, X., Zuo, Y. Spine plasticity in the motor cortex. Current opinion in neurobiology. 21, 169-174 (2011).
- Harms, K. J., Dunaevsky, A. Dendritic spine plasticity: looking beyond development. Brain research. 1184, 65-71 (2007).
- Segal, M. Dendritic spines and long-term plasticity. Nature reviews. Neuroscience. 6, 277-284 (2005).
- Tada, T., Sheng, M. Molecular mechanisms of dendritic spine morphogenesis. Current opinion in neurobiology. 16, 95-101 (2006).
- Alvarez, V. A., Sabatini, B. L. Anatomical and physiological plasticity of dendritic spines. Annual review of neuroscience. 30, 79-97 (2007).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
- Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nature protocols. 5, 201-208 (2010).
- Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature protocols. 4, 1128-1144 (2009).
- Drew, P. J., et al. Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull. Nature methods. 7, 981-984 (2010).
- Szu, J. I., et al. Thinned-skull cortical window technique for in vivo optical coherence tomography imaging. J Vis Exp. , (2012).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging. J Vis Exp. , (2008).
- Xu, T., et al. Rapid formation and selective stabilization of synapses for enduring motor memories. Nature. 462, 915-919 (2009).
- Fu, M., Yu, X., Lu, J., Zuo, Y. Repetitive motor learning induces coordinated formation of clustered dendritic spines in vivo. Nature. 483, 92-95 (2012).
- Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nature neuroscience. 8, 752-758 (2005).
- Tsai, J., Grutzendler, J., Duff, K., Gan, W. B. Fibrillar amyloid deposition leads to local synaptic abnormalities and breakage of neuronal branches. Nature neuroscience. 7, 1181-1183 (2004).
- Pan, F., Aldridge, G. M., Greenough, W. T., Gan, W. B. Dendritic spine instability and insensitivity to modulation by sensory experience in a mouse model of fragile X syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 17768-17773 (2010).
- Liu, Z., Condello, C., Schain, A., Harb, R., Grutzendler, J. CX3CR1 in microglia regulates brain amyloid deposition through selective protofibrillar amyloid-beta phagocytosis. J Neurosci. 30, 17091-17101 (2010).
- Tremblay, M. E., Zettel, M. L., Ison, J. R., Allen, P. D., Majewska, A. K. Effects of aging and sensory loss on glial cells in mouse visual and auditory cortices. Glia. 60, 541-558 (2012).
- Lam, C. K., Yoo, T., Hiner, B., Liu, Z., Grutzendler, J. Embolus extravasation is an alternative mechanism for cerebral microvascular recanalization. Nature. 465, 478-482 (2010).
- Kelly, E. A., Majewska, A. K. Chronic imaging of mouse visual cortex using a thinned-skull preparation. J Vis Exp. , (2010).
- Marker, D. F., Tremblay, M. E., Lu, S. M., Majewska, A. K., Gelbard, H. A. A thin-skull window technique for chronic two-photon in vivo imaging of murine microglia in models of neuroinflammation. J Vis Exp. , (2010).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain. J Vis Exp. , (2012).
- Zhang, L., et al. Imaging glioma initiation in vivo through a polished and reinforced thin-skull cranial window. J Vis Exp. , (2012).
- Pacary, E., et al. Visualization and genetic manipulation of dendrites and spines in the mouse cerebral cortex and hippocampus using in utero electroporation. J Vis Exp. , (2012).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental biology. 240, 237-246 (2001).
- Lowery, R. L., Majewska, A. K. Intracranial injection of adeno-associated viral vectors. J Vis Exp. , (2010).
- Taniguchi, H., et al. A resource of Cre driver lines for genetic targeting of GABAergic neurons in cerebral cortex. Neuron. 71, 995-1013 (2011).
- Zariwala, H. A., et al. A Cre-dependent GCaMP3 reporter mouse for neuronal imaging in vivo. J Neurosci. 32, 3131-3141 (2012).
- Kuhlman, S. J., Huang, Z. J. High-resolution labeling and functional manipulation of specific neuron types in mouse brain by Cre-activated viral gene expression. PloS one. 3, (2008).
