Vaccinia Reporter virus for å kvantifisere Viral funksjon på alle stadier av Gene Expression

Summary

Vi beskriver bruken av et fluorescerende reporter vaccinia virus som muliggjør sanntids måling av viral infektivitet og genekspresjon gjennom stadium-spesifikke ekspresjon av spektralt atskilte rapportør fluoroforer. Vi detalj en plate-basert fremgangsmåte for nøyaktig å identifisere stadiet hvor virusreplikasjon blir påvirket som reaksjon på lite molekyl hemming.

Abstract

Poxviruses er en familie av doble strandet DNA virus som inkluderer aktive menneskelige patogener som monkeypox, molluscum contagiousum og Contagalo virus. Familien omfatter også koppevirus, Variola. På grunn av kompleksiteten i poxvirus replikering, mange spørsmål fortsatt om deres genuttrykk strategi. I denne artikkelen beskriver vi konseptualisering og bruk av rekombinante vaccinia virus som muliggjør sanntidsmåling av enkle og flere stadier av viral genuttrykk i en high-throughput format. Dette aktiveres ved bruk av spectrally distinkte fluorescerende proteiner som journalister for hver av de tre stadier av virusreplikasjon. Disse virusene gir et høyt signal-til-støy-forholdet og samtidig beholde trinns spesifikke uttrykk mønstre, slik at plate-baserte analyser og mikroskopiske observasjoner av virusreplikasjon og formering. Disse verktøyene har bruk for antiviral oppdagelse, studier av virus-vert interaksjon, og evolusjonær biologi.

Introduction

Tradisjonelt er virus uttrykk studert ved hjelp av molekylærbiologiske teknikker (f.eks nordblotting, western blotting, microarray hybridisering, etc.) ^en. Selv om disse metodene er i stand til å gi detaljerte opplysninger med hensyn til å kategorisere uttrykk endringer av enkelte mRNA eller proteiner, de er vanligvis ikke mottagelig for real-time og høy gjennomstrømning prosesser. Alternative tilnærminger med fluoresens-baserte journalister har blitt brukt tidligere når du arbeider med poxviruses; har imidlertid deres utvikling og bruk blitt motivert av varierte mål. Flere slike fremgangsmåter ble utformet for seleksjon av rekombinante virus ^2,3. Disse teknikkene uttrykke EGFP ved riktig innlemmelse og uttrykk for eksogene DNA fra rekombinante vaccinia kloner. Tilsvarende flere vaccinia stammer stabilt uttrykker løselig EGFP eller GFP-merket proteiner uttrykt under en innfødt vaccinia arrangøren har blitt mye brukt. Disse er typtisk brukes til å kvantifisere virus oppføring og replikering under antistoff-baserte nøytraliseringstanker analyser, kjemisk hemming, eller sammenligning av antiviral effekt ^4-6. Selv om disse virus har vist seg nyttig, er de begrenset i sin evne til å gi detaljert informasjon om punktet for inhibering på grunn av deres bruk av en enkelt tvetydig tidlig / sen viral promoter. Tidligere metoder har også gjort bruk av EGFP protein med suboptimale signal-til-støy-egenskaper.

På grunn av kompleksiteten i poxvirus replikering og mangelen på eksisterende verktøy tilgjengelig til analysen sanntid endringer i viral genekspresjon, har vi utviklet en pakke med singel og flertrinns reporter virus ^7,8. Som beskrevet i tidligere publikasjoner, disse virusene uttrykke en, to, eller tre spectrally forskjellige fluorescerende proteiner fra innfødte vaccinia arrangører under tidlig, middels, eller sene stadier i infeksjon. Disse virusene kan være ossed som indikatorer på virusreplikasjon fremgang ved hjelp av en fluorescens mikroskop, og de er like godt egnet for high-throughput plate-og-leser baserte analyser. Disse virusene er enkle å bruke i stedet for villtype virus, vokser med liknende kinetikk for å nå tilsvarende titere ^7. Under planleggingen og etableringen av disse virusene, ble mye omsorg tatt i å velge fluoroforene som har høye signal-til-bakgrunn egenskaper med overlegen folde effektivitet for å lette pålitelig kvantifisering med rask tilbakemelding til endringer i uttrykk (Venus, mCherry og TagBFP). I tillegg ble kombinasjoner av viral arrangører valgt som produserer high fidelity, entydig scenen spesifikke uttrykk, og gir informasjon om hele spekteret av tidlig (C11R promoter), middels (G8R promoter) og sen (F17R promoter) genuttrykk, i motsetning til tvetydig tidlig / sent arrangører.

Disse virusene kan bli brukt som et verktøy for investigating livssyklusen til den prototypiske poxvirus, vacciniavirus. Mye er fortsatt ikke kjent om verten-virus samspill til tross for sin lange historie av studien. Vaccinia er kompleks, produsere over 200 unike proteiner, hvorav mange er immunmodulerende og vert antagonistiske. Ved infeksjon begynner vaccinia virus umiddelbart tidlig mRNA transkripsjon. Dette er tilrettelagt av en RNA polymerase og transkripsjonsfaktorer som ble lastet på viral genom under virion emballasje og holdt i en midlertidig stoppet status inntil infeksjon. Denne tidlige uttrykk produserer proteiner som kreves for undertrykkelse av vertens immunsystemet (mRNA Decapping, dsrna beslaglegging, og lokkefugl reseptor proteiner samt hemmere av apoptose, stress respons, og Toll, IL, og NF-κB signal) og genomet replikering. Tidlig uttrykk produserer også transkripsjonsfaktorer som er nødvendige for mellom uttrykk. Intermediate uttrykk inkluderer uttrykk for sent stadium transkripsjonsfaktorer. Detteexpression cascade fører til produksjon av strukturelle og enzymatiske virusproteiner i sene stadier av infeksjonen, som er nødvendig for fullstendig montering av det modne vaccinia virion.

Vårt sett av fluorescerende reporter virus muliggjør rask fremgang å bli gjort i forståelsen av poxvirus biologi. En av de mest vanlige og tidkrevende metoder innen virologien er veksten assay. Dette innebærer typisk å infisere celler, enacting en serie av behandlinger, høsting virus ved lysering av infiserte celler og kvantifisere resulterende viral titer ved plaque-assay. Ved hjelp av rapportørvirus som er beskrevet her gjør det mulig for sanntids måling av virusvekst som lett kan analyseres og sammenlignes mellom en rekke behandlinger som utføres i parallell. Vi regner med dette settet av reagenser vil bli brukt i ulike protokoller for å identifisere endringer i viral genuttrykk i respons til medikamentell behandling, RNAi knockdown, eller vertsområde begrensning.

Denne metode gjør det også mulig med høy innholdsanalyse på en større skala enn tidligere tilgjengelig, slik at for høy gjennomstrømning anti-viral medikamentskjermer for spesifikt definerte mål etapper av interesse. Mens mange potensielle behandlinger for å bekjempe poxvirus infeksjon har blitt identifisert, den eneste FDA godkjente terapi effektive for behandling av poxvirus infeksjon er den asykliske phosphonate nukleosid, Cidofovir, og behandling med vaccinia immunglobulin ^9,10. Til tross for utryddelsen av kopper i 1977 ^11, poxviruses fortsatt være en betydelig trussel mot menneskers helse ^12. Opphør av utbredt vaksinering mot Variola viruset har ført til økt mottakelighet for andre poxviruses ^13. For eksempel er regioner i Sentral-Afrika tidligere beskyttet av vaksinasjon opplever en bølge i Monkeypox virusinfeksjoner ^14. Betydelig bekymring har også værtreist om den latente mottakelighet for bevisst utsetting av Variola virus. På grunn av de begrensede behandlinger for tiden tilgjengelig, det er et presserende behov for utvikling av nye behandlinger. Disse rapportørvirus tillater rask og høy gjennomstrømning lite molekyl inhibitor screening for hemming av en spesifikk fase av viral replikasjon. Identifisering av hemmere som retter seg mot virus uttrykk stadier øyeblikket ikke målet for hemming vil lette utviklingen av kombinasjonsterapi med økt potens.

Mye kan merkes om vaccinia cellebiologi ved å observere endringer i hver fase er genuttrykk. Demping av kjemisk eller genetisk manipulering av en infisert vertcelle er vanligvis uttrykt i form av reduserte virale titere. Men ved å sammenligne endringer i hvert stadium av viral uttrykk cascade, kan man få en mer fullstendig forståelse av hvordan virus fitness er virkningensert ved en bestemt behandling. Disse data har vist seg å korrelere godt med den tradisjonelle virustiter utgang, men mer detaljert mekanistisk informasjon, så vel som høy gjennomstrømning evner ^7.

Protocol

En. Plate Cells Dissosiere HeLa-celler fra platen og fortynnes i vekstmedium (DMEM, 2 mM L-glut, 10% FBS) til omtrent 2,0 x 10 5 celler / ml. Tilsett 100 ul / brønn i en svart-vegger, klar flatbunnet 96-brønns plate (20 000 celler / brønn). Inkuber cellene ved 24 timer inntil sammenflytende i en 37 ° C inkubator + 5% CO2. 2. Infisere celler Spe virus og infisere celler. Thaw TrpV (Triple virus; Tidlig Venus, Intermediat…

Representative Results

Som et eksempel på en typisk bruk av disse viruser, ble trippel fluorescens-reporter virus brukes til å sammenligne det punktet av hemming av flere veldefinerte poxvirus-inhibitorer. HeLa-celler ble sådd ut i vevskultur behandlede sorte vegger klare flatbunnet 96-brønners plater og inkubert over natten. Sammenflytende monolag ble infisert ved en multiplisitet for infeksjon (MOI) på 10 ved hjelp av enten trippel reporter virus (TrpV, tabell 1), eller promoter-mindre Venu…

Discussion

Her har vi beskrevet den praktiske bruken av en flertrinns vaccinia reporter virus (TrpV), noe som gir reproduserbare, tilbakemelding i sanntid tiltak av virusreplikasjon. Ved å bruke veldefinerte Poxvirus hemmere, var vi i stand til å vise at TrpV reagerer på en måte som samsvarer med den forstått virkningsmekanisme for hver inhibitor. Mens TrpV viruset gir den mest omfattende informasjon om virus scenen progresjon, to-trinns (IREV, LREV) og ett-trinns (EV, IV, LV) virus kan også brukes på samme måte, drar nytt…

Materials

Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11995-065
Fetal Bovine Serum – Optima, Heat Inactivated (FBS)	Atlanta Biologicals	S12450H
200 mM L-Glutamine, (L-glut)	Gibco	25030-081
96 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates	Corning	3603
384 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates	Corning	3712
Trypsin, 2X, Sterile, Irradiated	Worthington Biochemical Corp.	TRLVMF
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Gibco	10010-023
Dimethyl Sulfoxide, Cell Culture (DMSO)	American Bioanalytical	AB03091
1-β-D-Arabinofuranosylcytosine  (AraC), MW= 280 g/mol	SigmaAldrich Co	C6645
isatin β -thiosemicarbazone (IBT), MW= 234 g/mol	Fisher Scientific	NC9075202
Rifampicin, MW= 823 g/mol	SigmaAldrich Co	R3501
ST-246, MW= 376 g/mol	SIGA Labs, Corvallis, OR
8% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution	Electron Microscopy Sciences	157-8
TempPlate RT optically clear film	USA Scientific	2978-2700
Opti-MEM Reduced Serum Medium	Gibco	31985-070