Linear Amplification vermittelte PCR - Lokalisierung von genetischen Elementen und Charakterisierung von Unbekannt flankierenden DNA-
Summary
Linear-vermittelte Amplifikation (LAM)-PCR ist eine Abwicklung, die genauen Positionen der Integration von viraler Vektoren in das Genom zu identifizieren Verfahren. Die Technik hat sich weiterentwickelt, um die überlegene Methode zur klonalen Dynamik in der Gentherapie-Patienten, biologische Sicherheit von neuartigen Technologien Vektor, T-Zell-Vielfalt, die Krebsstammzellen Modelle usw. studieren
Abstract
Linear-amplification mediated PCR (LAM-PCR) has been developed to study hematopoiesis in gene corrected cells of patients treated by gene therapy with integrating vector systems. Due to the stable integration of retroviral vectors, integration sites can be used to study the clonal fate of individual cells and their progeny. LAM- PCR for the first time provided evidence that leukemia in gene therapy treated patients originated from provirus induced overexpression of a neighboring proto-oncogene. The high sensitivity and specificity of LAM-PCR compared to existing methods like inverse PCR and ligation mediated (LM)-PCR is achieved by an initial preamplification step (linear PCR of 100 cycles) using biotinylated vector specific primers which allow subsequent reaction steps to be carried out on solid phase (magnetic beads). LAM-PCR is currently the most sensitive method available to identify unknown DNA which is located in the proximity of known DNA. Recently, a variant of LAM-PCR has been developed that circumvents restriction digest thus abrogating retrieval bias of integration sites and enables a comprehensive analysis of provirus locations in host genomes. The following protocol explains step-by-step the amplification of both 3’- and 5’- sequences adjacent to the integrated lentiviral vector.
Introduction
Linear-PCR-vermittelte Amplifikation (LAM-PCR) ermöglicht die Identifizierung und Charakterisierung von unbekannten flankierenden DNA benachbart zu bekannten DNA beliebigen Ursprungs. Genauer gesagt, LAM-PCR wurde zur viralen Vektor Integrationsstellen zu lokalisieren (IS) innerhalb des Wirtsgenoms 1,2. Genetische Elemente wie Transposons oder Retroviren integrieren ihr Genom in das Wirtsgenom in einer (halb-) zufälliger Weise 3-6. In vielen Fällen ist es entscheidend, genau die Position, wo diese Vektoren integriert kennen. LAM-PCR nachgewiesen worden überlegen alternative Techniken wie PCR-vermittelte Ligation 7 und seiner Varianten oder inversen PCR-8 sein. Die Empfindlichkeit und Robustheit dieses Verfahrens ergibt sich aus der anfänglichen Vorverstärkung der Vektor-Genom Gänge und magnetische Auswahl amplifizierte PCR-Produkte. Wie die genannten alternativen Verfahren beruht LAM-PCR auf der Verwendung von Restriktionsenzymen, die Einführung eines Bias in Abrufkapazität 9-11. Folglichnur ein Teil des IS-Repertoire (die integrome) in einer Reaktion nachgewiesen werden. Diese Vorspannung wird durch die parallele Analyse einer gegebenen Probe mit optimalen Kombinationen von Restriktionsenzymen 9 minimiert. Kürzlich wurde eine Variante der Technik bezeichnet nicht einschränkenden LAM-PCR (nrLAM-PCR) entwickelt worden, die die Verwendung von Restriktionsenzymen umgeht und ermöglicht unvoreingenommene genomweiten Analyse einer Probe in einem einzigen Reaktions 9,12.
In der Vergangenheit LAM-PCR wurde zur Identifizierung der Verursacher retroviralen IS, die zu Leukämie bei einigen Patienten in der klinischen Gentherapie-Versuche 13-15. Seitdem LAM-PCR wurde angepasst, um zu identifizieren, ist von anderen Integrationsvektoren (lentiviralen Vektoren, Transposons) sowie Integrationsmuster passiv integrierende Vektoren wie Adeno-assoziierten Vektoren (AAV) oder Integrase-defekt lentiviralen Vektoren (IDLV) identifizieren 16 -21. Anwendungen der LAM-PCR sind weit verbreitet: traditionellely, die Technik ist weit verbreitet, um die klonale Zusammensetzung von Gen-veränderten Zellen bei Patienten, die Gen-Therapie unterzogen haben oder studieren, um die biologische Sicherheit von neuartigen Vektorsysteme mit der Entschlüsselung ihrer Integration 15,16,22-24 Verhalten zu beurteilen. Kürzlich LAM-PCR aktiviert Bestimmung Spezifität und Off-Target-Aktivität von Designer-Nukleasen durch eine IDLV Trapping-Assay 25.
Darüber hinaus ermöglicht LAM-PCR, um leicht folgen das Schicksal einer Zelle transduziert im Laufe der Zeit in einem Organismus. Dies erlaubt es, Proto-Onkogene als auch Tumor-Suppressor-Gene zu identifizieren und auch zu Blutbildung oder Krebsstammzellbiologie 26-28 studieren. Nicht zuletzt, LAM-PCR wurde an T-Zell-Rezeptor-Diversity beim Menschen 29 (unveröffentlichte Daten) zu studieren.
Die Eigenleistung der Technik wird durch die Verknüpfung der Methode, um tiefe Sequenzierungstechnologien, die Charakterisierung von Millionen von unbekannten flankierenden DNA mit Einzel-Nukleotid-r erlauben verstärkteSOLUTION in ganzer Genome. In dem folgenden Protokoll beschreiben wir Schritt für Schritt die Amplifikation und Identifizierung von unbekannten DNA-flankierenden exemplarisch zu identifizieren Lentivirusvektor IST. Oligonukleotide in dem Protokoll verwendet wird, sind in Tabelle 1 aufgeführt. Heraus DNA oder cDNA von jeder Quelle kann als DNA-Matrize für LAM-PCR und nrLAM-PCR verwendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die LAM-PCR-Technik ermöglicht die Identifizierung von unbekannten DNA-Sequenzen, die eine bekannte DNA-Region flankieren. Wegen der hohen Empfindlichkeit von Vorverstärkung der Verbindungen mit spezifischen Primern hybridisiert in der bekannten DNA-Sequenz ergeben, ist es möglich, zu verstärken und zu detektieren, auch seltene Kreuzungen auf Einzelzellebene. Gegenteil, in einem polyklonalen Situation LAM-PCR ist in der Lage, Tausende von verschiedenen Verbindungen in einer einzigen Reaktion zu verstärken.
<p c…Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Funding was provided by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (SPP1230, grant of the Tumor Center Heidelberg/Mannheim), by the Bundesministerium für Bildung und Forschung (iGene), by the VIth + VIIth Framework Programs of the European Commission (CONSERT, CLINIGENE and PERSIST). We thank Ina Kutschera for demonstrating the protocol technique in the video.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Taq DNA Polymerase | Genaxxon Bioscience GmbH | M3001.5000 | Alternative Taq Polymerases may be used |
| PCR Buffer | Qiagen | 201203 | Use of this buffer is recommended |
| dNTP-Mixture | Genaxxon Bioscience GmbH | M3015.4020 | or any other dNTPs |
| Oligonucleotides (Primers) | MWG Biotech | HPLC purified | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | 11206D | |
| PBS | Gibco | 14190-086 | 0.1 % wt/vol BSA |
| 6M LiCl | Roth | 3739.1 | 10 mM Tris-HCl (pH 7.5)/1 mM EDTA |
| Tris-HCl, pH 7.5 | USB Corporation | 22637 | or any other supplier |
| EDTA | Applichem | A1103,0250 | or any other supplier |
| Klenow Polymerase | Roche Diagnostics | 10104523001 | |
| Hexanucleotide mixture | Roche Diagnostics | 11277081001 | |
| Restriction endonuclease | NEB | or any other supplier | |
| Fast-Link DNA ligation kit | Epicentre Biotechnologies | LK11025 | |
| CircLigase ssDNA Ligase Kit | Epicentre Biotechnologies | CL4111K | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 72068 | or any other supplier |
| Agarose LE | Roche Diagnostics | 11685660001 | or any other supplier |
| TBE buffer | Amresco | 0658 | or any other supplier |
| Ethidium bromide | Applichem | A2273,0005 | Ethidium bromide is mutagenic |
| 100 bp DNA Ladder | Invitrogen | 15628-050 | or any other DNA ladder |
| 20 mM NaCl | Sigma-Aldrich | 71393-1L | or any other supplier |
| Magna-Sep Magnetic Particle Separator | Life Technologies | K158501 | for use with 1.5 ml Tubes |
| Magna-Sep Magnetic Particle Separator | Life Technologies | K158696 | for use with 96 well plates |
| Amicon Ultra-0.5, Ultracel-30 membrane | Millipore | UFC503096 | |
| PerfectBlue Gelsystem Midi S | PeqLab | 40-1515 | or other electrophoresis system |
| TProfessional 96 | Biometra | 050-551 | or other Thermocycler for 96-well plates |
| Orbital shaker KS 260 basic | IKA | 2980200 | or other horizontal shaker |
| PCR softtubes 0.2 ml | Biozym Scientific GmbH | 711082 | or other 0.2 ml PCR tubes |
| 1.5 ml tubes | Eppendorf | 12682 | or other 1.5 ml tubes |
| Gel documentation system | PeqLab | or any other gel documentation system | |
| Nanodrop ND-1000 spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| Spreadex EL1200 precast gel | Elchrom Scientific | 3497 | |
| Submerged gel electrophoresis apparatus SEA 2000 | Elchrom Scientific | 2001E | |
| 2100 Electrophoresis Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939AA |
Referências
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