Linear-förstärkning medierad (LAM)-PCR är en metod som utvecklats för att identifiera de exakta positionerna för att integrera virala vektorer i genomet. Tekniken har utvecklats till att bli den överlägsna metoden för att studera klonala dynamik i genterapipatienter, biosäkerhet av nya vektorteknik, T-cells mångfald, cancerstamcellsmodeller etc.
Linear-amplification mediated PCR (LAM-PCR) has been developed to study hematopoiesis in gene corrected cells of patients treated by gene therapy with integrating vector systems. Due to the stable integration of retroviral vectors, integration sites can be used to study the clonal fate of individual cells and their progeny. LAM- PCR for the first time provided evidence that leukemia in gene therapy treated patients originated from provirus induced overexpression of a neighboring proto-oncogene. The high sensitivity and specificity of LAM-PCR compared to existing methods like inverse PCR and ligation mediated (LM)-PCR is achieved by an initial preamplification step (linear PCR of 100 cycles) using biotinylated vector specific primers which allow subsequent reaction steps to be carried out on solid phase (magnetic beads). LAM-PCR is currently the most sensitive method available to identify unknown DNA which is located in the proximity of known DNA. Recently, a variant of LAM-PCR has been developed that circumvents restriction digest thus abrogating retrieval bias of integration sites and enables a comprehensive analysis of provirus locations in host genomes. The following protocol explains step-by-step the amplification of both 3’- and 5’- sequences adjacent to the integrated lentiviral vector.
Linear-förstärkning medierad PCR (LAM-PCR) möjliggör att identifiera och karakterisera okända flankerande DNA intill kända DNA av orsak. Mer specifikt har LAM-PCR har utvecklats för att lokalisera viral vektor integrationsställen (IS) inom värdgenomet 1,2. Genetiska faktorer som retrovirus eller transposoner integrerar sitt genom i värdgenomet i en (halv-) slumpmässigt sätt 3-6. I många fall är det avgörande att veta exakt den position där dessa vektorer integrerade. LAM-PCR har visat sig vara överlägsen alternativa tekniker som ligation-medierad PCR 7 och dess varianter eller invers PCR 8. Känsligheten och robusthet av denna metod härrör från den första förförstärkning av vektor-genomet korsningar och magnetiska urval av förstärkta PCR-produkter. I likhet med de alternativa metoder som nämns, LAM-PCR förlitar sig på användningen av restriktionsenzymer, införande av en förspänning i inhämtnings kapacitet av IS 9-11. Sålundaendast en delmängd av IS repertoaren (det integrome) kan detekteras i en reaktion. Denna bias minimeras genom parallell analys av ett givet prov med hjälp av optimala kombinationer av restriktionsenzymer 9. Nyligen, en variant av tekniken kallas icke-restriktiv LAM-PCR (nrLAM-PCR) har utvecklats som kringgår användningen av restriktionsenzymer och tillåter opartisk genomet hela analysen av ett prov i en enda reaktion 9,12.
I det förflutna har LAM-PCR använts för att identifiera den orsakande retroviral ger upphov till leukemi hos några patienter i kliniska genterapiförsök 13-15. Sedan dess har LAM-PCR anpassats för att identifiera IS från andra integrerande vektorer (lentivirala vektorer, transposoner) och även för att identifiera integrationsmönster passivt integrerande vektorer som adenoassocierade vektorer (AAV) eller gras-defekt lentivirusvektorer (IDLV) 16 -21. Tillämpningar av LAM-PCR är stor spridning: traditionellly, är den teknik som används i stor utsträckning för att studera klon sammansättningen av genmodifierade celler hos patienter som genomgått genterapi eller för att bedöma biosäkerhet av nya vektorsystem genom att reda ut deras integration beteende 15,16,22-24. Nyligen, LAM-PCR aktiverat bestämma specificitet och off-aktivitetsmål av designade nukleaser av en IDLV fånga analys 25.
Dessutom LAM-PCR tillåter att enkelt följa ödet för en omvandlade cellen över tiden i en organism. Detta gör det möjligt att identifiera proto-onkogener samt tumörsuppressorgener och även för att studera blodbildningen eller cancerstamcellsbiologi 26-28. Sist men inte minst, var LAM-PCR anpassad för att studera T-cellsreceptor mångfald hos människor 29 (och opublicerade data).
Den inneboende kraften i teknik förstärks genom att koppla metoden till djupa sekvensering teknik som gör det möjligt att karakterisera miljontals okända flankerande DNA med enda nukleotid resolution i hela genom. I följande protokoll, beskriver vi steg för steg förstärkning och identifiering av flankerande okända DNA såsom exempel för att identifiera lentivirusvektor IS. Oligonukleotider som används i protokollet är listade i tabell 1. Extraherat DNA eller cDNA någon källa kan användas som DNA-mall för LAM-PCR och nrLAM-PCR.
LAM-PCR-tekniken tillåter identifiering av okända DNA-sekvenser som flankerar en känd DNA-region. På grund av den höga känslighet som har uppstått genom föramplifiering av övergångarna med specifika primrar som hybridiserar i den kända DNA-sekvensen, är det möjligt att amplifiera och detektera även sällsynta övergångarna ned till enkelcellnivå. I motsats, i en polyklonal situation LAM-PCR kan förstärka tusentals olika korsningar i en enda reaktion.
Men på grund av använ…
The authors have nothing to disclose.
Funding was provided by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (SPP1230, grant of the Tumor Center Heidelberg/Mannheim), by the Bundesministerium für Bildung und Forschung (iGene), by the VIth + VIIth Framework Programs of the European Commission (CONSERT, CLINIGENE and PERSIST). We thank Ina Kutschera for demonstrating the protocol technique in the video.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Taq DNA Polymerase | Genaxxon Bioscience GmbH | M3001.5000 | Alternative Taq Polymerases may be used |
PCR Buffer | Qiagen | 201203 | Use of this buffer is recommended |
dNTP-Mixture | Genaxxon Bioscience GmbH | M3015.4020 | or any other dNTPs |
Oligonucleotides (Primers) | MWG Biotech | HPLC purified | |
Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | 11206D | |
PBS | Gibco | 14190-086 | 0.1 % wt/vol BSA |
6M LiCl | Roth | 3739.1 | 10 mM Tris-HCl (pH 7.5)/1 mM EDTA |
Tris-HCl, pH 7.5 | USB Corporation | 22637 | or any other supplier |
EDTA | Applichem | A1103,0250 | or any other supplier |
Klenow Polymerase | Roche Diagnostics | 10104523001 | |
Hexanucleotide mixture | Roche Diagnostics | 11277081001 | |
Restriction endonuclease | NEB | or any other supplier | |
Fast-Link DNA ligation kit | Epicentre Biotechnologies | LK11025 | |
CircLigase ssDNA Ligase Kit | Epicentre Biotechnologies | CL4111K | |
NaOH | Sigma-Aldrich | 72068 | or any other supplier |
Agarose LE | Roche Diagnostics | 11685660001 | or any other supplier |
TBE buffer | Amresco | 0658 | or any other supplier |
Ethidium bromide | Applichem | A2273,0005 | Ethidium bromide is mutagenic |
100 bp DNA Ladder | Invitrogen | 15628-050 | or any other DNA ladder |
20 mM NaCl | Sigma-Aldrich | 71393-1L | or any other supplier |
Magna-Sep Magnetic Particle Separator | Life Technologies | K158501 | for use with 1.5 ml Tubes |
Magna-Sep Magnetic Particle Separator | Life Technologies | K158696 | for use with 96 well plates |
Amicon Ultra-0.5, Ultracel-30 membrane | Millipore | UFC503096 | |
PerfectBlue Gelsystem Midi S | PeqLab | 40-1515 | or other electrophoresis system |
TProfessional 96 | Biometra | 050-551 | or other Thermocycler for 96-well plates |
Orbital shaker KS 260 basic | IKA | 2980200 | or other horizontal shaker |
PCR softtubes 0.2 ml | Biozym Scientific GmbH | 711082 | or other 0.2 ml PCR tubes |
1.5 ml tubes | Eppendorf | 12682 | or other 1.5 ml tubes |
Gel documentation system | PeqLab | or any other gel documentation system | |
Nanodrop ND-1000 spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-1000 | |
Spreadex EL1200 precast gel | Elchrom Scientific | 3497 | |
Submerged gel electrophoresis apparatus SEA 2000 | Elchrom Scientific | 2001E | |
2100 Electrophoresis Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939AA |