Aip1p Dynamics ændres med R256H mutation i Actin
Summary
Sygdomsfremkaldende mutationer i actin kan ændre cytoskelet funktion. Cytoskeletal dynamik kvantificeres gennem billeddannelse af fluorescens mærkede proteiner ved hjælp af total intern fluorescens mikroskopi. Som et eksempel har cytoskeletprotein, Aip1p, ændret lokalisering og bevægelse i celler, der udtrykker mutant actin isoform R256H.
Abstract
Mutationer i actin forårsage en række humane sygdomme på grund af specifikke molekylære ændringer, som ofte ændrer cytoskelet funktion. I denne undersøgelse, billeddannelse af fluorescens-mærkede proteiner ved hjælp af total intern fluorescens (TIRF) mikroskopi anvendes til at visualisere og kvantificere ændringerne i cytoskeletale dynamik. TIRF mikroskopi og brug af fluorescerende tags også mulighed for kvantificering af ændringer i cytoskeletal dynamik forårsaget af mutationer i aktin. Ved at bruge denne teknik, kvantificering af cytoskeletal funktion i levende celler værdifuldt supplement in vitro-undersøgelser af protein funktion. Som et eksempel har missense mutationer påvirker actin rest R256 blevet identificeret i tre humane actin isoformer tyder denne aminosyre spiller en vigtig rolle i regulatoriske interaktioner. Virkningerne af actin mutation R256H på cytoskeletal bevægelser blev undersøgt ved hjælp af gær-modellen. Proteinet Aip1, der er kendt for at hjælpe cofilin i actin depolymerisering varmarkeret med grønt fluorescerende protein (GFP) ved N-terminalen og spores in vivo under anvendelse TIRF mikroskopi. Satsen for Aip1p bevægelse i både vildtype og mutant-stammer blev kvantificeret. I celler, der udtrykker R256H mutant actin er Aip1p bevægelse begrænset, og hastigheden af bevægelsen er næsten halvdelen af den hastighed, målt i vildtype-celler (0,88 ± 0,30 mM / sek i R256H celler i forhold til 1,60 ± 0,42 mM / sek i vild type celler, s. <0,005).
Introduction
Actin er den dominerende protein, der omfatter cytoskeleton og deltager i kritiske cellulære processer, herunder celledeling, organelle bevægelse, celle motilitet, sammentrækning, og signalering. Gennem det seneste årti, har sygdomsfremkaldende mutationer i actin blevet opdaget i hver af de seks menneskelige aktin isoformer, der fører til en række lidelser, fra myopathies til koronararteriesygdom 1-7. De processer, som actin mutationer fører til sygdom fortsætter med at blive belyst. Gæren model fortsat guldstandarden til at studere de biokemiske virkninger af mutationer på actin funktion på grund af de fordele ved den fælles væsentlige actin isoform, genetisk sporbarhed og høj bevarelse af actin sekvens og funktion. Undersøgelser viser, at individuelle actin mutationer føre til molekylære specifikke dysfunktioner med dominerende negative virkninger 8. For eksempel døvhed-forårsager mutationer i γ-non-muskel actin som påvirker Lys-118 rest ændre regulering afactin-bindende protein Arp2 / 3 9. Undersøgelser ofte anvender in vitro-analyser af protein: protein-interaktioner. Undersøgelser af virkningen af actin mutationer på cellebiologi og navnlig actinbindende protein lokalisering i cellen er begrænsede.
Undersøgelser af gær cytoskeleton in vivo konventionelt afhængige billeder af fikserede celler fra et inverteret fluorescensmikroskop 10. Disse eksperimenter leveres fundamentale data om morfologien af actin cytoskeleton. Undersøgelser har siden indarbejdet tredimensionel konfokal billedbehandling for at visualisere den komplekse cytoskeletal netværk 11, 12. Denne billeddannelse tillader kvantificering af overflod og relative placering af actin patches og filamenter. Tyndslib elektron tomografi er blevet brugt til billede morfologi de tætte trådformede netværk i forhold til bevarede subcellulære strukturer 13. Overfyldte cellulære sgangarter med et lille tværsnit kan undersøges i fine detaljer med denne teknik. Billeddiagnostiske undersøgelser er blevet udvidet til levende celler ved hjælp af tidsforskydningen fluorescerende mikroskopi. Når foto blegning og baggrundsfluorescens kan modereres, tid bortfalder billeddannelse giver undersøgelser, at dynamikken i cytoskeletproteiner og reaktionen på miljøforhold 11, 14. Separat blev visualisering af dynamikken i actinfilamenter in vitro fremført ved indførelse af total indre refleksion fluorescens (TIRF) mikroskopi. Sammenlignet med bredt felt mikroskopi TIRF har fordelen af reduceret baggrundsfluorescens og forbedret kontrast til at overvåge individuelle filamenter 15, 16. Med disse kvaliteter har TIRF mikroskopi blevet tilpasset af cellebiologer at overvåge cellulære strukturer på plasmamembranen 17, 18. Cellulære begivenheder, herunder ændringer i cytoskelettet, kanvisualiseres realtid med lav fototoksicitet, maksimal kontrast og minimal baggrund fluorescens 19.
For bedre at forstå virkningen af actin mutationer på bevægelse, lokalisering, og omsætningen af cytoskeletale proteiner i cellen, TIRF mikroskopi og protein tagging blev anvendt. Heri er fremgangsmåder til at studere virkningerne af en klinisk relevant mutation i actin på cytoskeletale dynamik i Saccharomyces cerevisiae beskrevet. Specifikt lokalisering og bevægelse af actinbindende protein Aip1p blev visualiseret og kvantificeret i celler, der udtrykker R256H mutation i actin. Disse teknikker supplere in vitro biokemiske undersøgelser og giver mulighed for en større forståelse af protein interaktioner og funktioner.
Protocol
Representative Results
Discussion
En effektiv strategi til at visualisere dynamikken i cytoskelettet og anvendelighed i undersøgelser af patogene mutationer er blevet beskrevet her. Avancerede billeddiagnostiske metoder har skabt nye muligheder for at forstå den intracellulære flytning af proteiner nær cellemembranen. Total intern refleksion fluorescens mikroskopi (TIRF) er en følsom teknik til funktionelle studier i levende celler. TIRF bruger en vinklet excitation laser, der skaber et rumligt dæmpede felt på grund af forskellen i brydningsindek…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Peter Rubenstein for nyttige diskussioner og teknisk rådgivning og David Pellman for det oprindelige PB1996 klon. Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra March of Dimes og finansiering fra Ride for børnene.
Materials
| Agarose | rpi | 9012-36-6 | |
| Bromophenol Blue | Amresco | 115-39-9 | |
| BSA | NEB | B9001S | |
| Change-IT Multiple Mutation Site Directed Mutagenesis Kit | USB Corporation | 4166059 | |
| CutSmart Buffer | NEB | B7204S | |
| DNA, single stranded from salmon testes | Sigma | 9007-49-2 | |
| EDTA pH 7.4 | Sigma | 93302 | |
| Ethidium Bromide | Invitrogen | 15585-011 | Warning! Harmful irritation |
| Fungal/Bacterial DNA Kit | Symo Research | D6005 | |
| HpaI | NEB | R0105S | |
| Lithium Acetate | AlfaAesar | 6108-17-4 | |
| Low DNA Mass Ladder | Invitrogen | 10068-013 | |
| NE Buffer #4 | NEB | B7004S | |
| Platinum PCR SuperMix High Fidelity | Invitrogen | 12532-016 | |
| Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | Any kit will work |
| Quick Ligation Kit | NEB | M2200S | |
| Sodium azide | Sigma | 26628-22-8 | |
| PBS | Invitrogen | 10010-023 | |
| PEG | Amresco | 25322-68-3 | |
| Tris Base Ultrapure | rpi | 77-86-1 | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | 1/6/2015 | |
| XhoI | NEB | R0146S | |
| XmaI | NEB | R0180S | |
| YPD media | LabExpress | 3011 | |
| -URA Media | LabExpress | 3010 | |
| PCR Machine | Invitrogen | 4359659 | Any PCR machine will work |
| TIRF Microscope | Olympus IX81 | ||
| Hamamatsu ORCA-R camera | Hamamatsu |
Referências
- Lehtonen, H. J., et al. Segregation of a missense variant in enteric smooth muscle actin gamma-2 with autosomal dominant familial visceral myopathy. Gastroenterology. 143, 1482-1491 (2012).
- Matsson, H., et al. Alpha-cardiac actin mutations produce atrial septal defects. Hum Mol Genet. 17, 256-265 (2008).
- Zhu, M., et al. Mutations in the gamma-actin gene (ACTG1) are associated with dominant progressive deafness (DFNA20/26). Am J Hum Genet. 73, 1082-1091 (2003).
- Nowak, K. J., et al. Mutations in the skeletal muscle alpha-actin gene in patients with actin myopathy and nemaline myopathy. Nat Genet. 23, 208-212 (1999).
- Olson, T. M., Michels, V. V., Thibodeau, S. N., Tai, Y. S., Keating, M. T. Actin mutations in dilated cardiomyopathy, a heritable form of heart failure. Science. 280, 750-752 (1998).
- Riviere, J. B., et al. De novo mutations in the actin genes ACTB and ACTG1 cause Baraitser-Winter syndrome. Nat Genet. 44, 440-444 (2012).
- Guo, D. C., et al. Mutations in smooth muscle alpha-actin (ACTA2) lead to thoracic aortic aneurysms and dissections. Nat Genet. 39, 1488-1493 (2007).
- Sparrow, J. C., et al. Muscle disease caused by mutations in the skeletal muscle alpha-actin gene (ACTA1). Neuromuscul Disord. 13, 519-531 (2003).
- Kruth, K. A., Rubenstein, P. A. Two deafness-causing (DFNA20/26) actin mutations affect Arp2/3-dependent actin regulation. J Biol Chem. 287, 27217-27226 (2012).
- Amberg, D. C. Three-dimensional imaging of the yeast actin cytoskeleton through the budding cell cycle. Mol Biol Cell. 9, 3259-3262 (1998).
- Pelham, R. J., Chang, F. Role of actin polymerization and actin cables in actin-patch movement in Schizosaccharomyces pombe. Nat Cell Biol. 3, 235-244 (2001).
- Vavylonis, D., Wu, J. Q., Hao, S., O’Shaughnessy, B., Pollard, T. D. Assembly mechanism of the contractile ring for cytokinesis by fission yeast. Science. 319, 97-100 (2008).
- Bertin, A., et al. Three-dimensional ultrastructure of the septin filament network in Saccharomyces cerevisiae. Mol Biol Cell. 23, 423-432 (2012).
- Senning, E. N., Marcus, A. H. Actin polymerization driven mitochondrial transport in mating S. cerevisiae. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 107, 721-725 (2010).
- Breitsprecher, D., Kiesewetter, A. K., Linkner, J., Faix, J. Analysis of actin assembly by in vitro TIRF microscopy. Methods Mol Biol. 571, 401-415 (2009).
- Popp, D., Narita, A., Iwasa, M., Maeda, Y., Robinson, R. C. Molecular mechanism of bundle formation by the bacterial actin ParM. Biochem Biophys Res Commun. 391, 1598-1603 (2010).
- Trache, A., Lim, S. M. Live cell response to mechanical stimulation studied by integrated optical and atomic force microscopy. J Vis Exp. (44), (2010).
- Spira, F., Dominguez-Escobar, J., Muller, N., Wedlich-Soldner, R. Visualization of cortex organization and dynamics in microorganisms, using total internal reflection fluorescence microscopy. J Vis Exp. (63), e3982 (2012).
- Manneville, J. B. Use of TIRF microscopy to visualize actin and microtubules in migrating cells. Methods Enzymol. 406, 520-532 (2006).
- Cook, R. K., Sheff, D. R., Rubenstein, P. A. Unusual metabolism of the yeast actin amino terminus. J Biol Chem. 266, 16825-16833 (1991).
- Feng, L., et al. Fluorescence probing of yeast actin subdomain 3/4 hydrophobic loop 262-274. Actin-actin and actin-myosin interactions in actin filaments. J Biol Chem. 272, 16829-16837 (1997).
- Lin, M. C., Galletta, B. J., Sept, D., Cooper, J. A. Overlapping and distinct functions for cofilin, coronin and Aip1 in actin dynamics in vivo. J Cell Sci. 123, 1329-1342 (2010).
- Malloy, L. E., et al. Thoracic Aortic Aneurysm (TAAD)-causing Mutation in Actin Affects Formin Regulation of Polymerization. J Biol Chem. 287, 28398-28408 (2012).
- Smyth, J. W., Shaw, R. M. Visualizing ion channel dynamics at the plasma membrane. Heart Rhythm. 5, S7-S11 (2008).
- Bhattacharya, R., et al. Recruitment of vimentin to the cell surface by beta3 integrin and plectin mediates adhesion strength. J Cell Sci. 122, 1390-1400 (2009).
- Hetheridge, C., et al. The formin FMNL3 is a cytoskeletal regulator of angiogenesis. J Cell Sci. 125, 1420-1428 (2012).
- Bergeron, S. E., et al. Allele-specific effects of thoracic aortic aneurysm and dissection alpha-smooth muscle actin mutations on actin function. J Biol Chem. 286, 11356-11369 (2011).
