Quantifier simple microvaisseaux perméabilité d'isolement de poumon de rat Préparation du sang perfusé
Summary
La préparation des poumons dans le sang perfusé isolé, il est possible de visualiser des réseaux microvasculaires à la surface du poumon. Ici, nous décrivons une méthode pour quantifier la perméabilité des microvaisseaux simples dans les poumons isolés en utilisant l'imagerie de fluorescence en temps réel.
Abstract
La préparation des poumons dans le sang perfusé isolé est largement utilisé pour visualiser et définir la signalisation dans les microvaisseaux simples. Par couplage de cette préparation avec une imagerie en temps réel, il devient possible de déterminer les changements de perméabilité dans les microvaisseaux pulmonaires individuels. Nous décrivons ici les étapes pour isoler les poumons de rats et de les perfuser avec du sang autologue. Ensuite, nous présentons des mesures pour insuffler fluorophores ou des agents via un micro-cathéter dans une petite région du poumon. L'utilisation de ces procédures décrites, nous avons déterminé perméabilité augmente chez le rat microvaisseaux pulmonaires en réponse aux perfusions de lipopolysaccharide bactérien. Les données ont révélé que le lipopolysaccharide augmenté fuite de fluide dans les deux segments de veinules et capillaires microvaisseaux. Ainsi, cette méthode permet de comparer les réponses de la perméabilité entre les segments vasculaires et ainsi, définir une hétérogénéité dans la réponse. Bien que les méthodes couramment utilisées pour définir la perméabilité pulmonaire post-traitement nécessitent des échantillons de tissus du poumon, leutilisation de l'imagerie en temps réel permet d'éviter que cette exigence évidente à partir de la présente méthode. Ainsi, la préparation du poumon isolé combinée avec l'imagerie en temps réel offre plusieurs avantages par rapport aux méthodes traditionnelles pour déterminer microvasculaire pulmonaire perméabilité, mais est une méthode simple à développer et à mettre en œuvre.
Introduction
Augmentation de la perméabilité microvasculaire dans les poumons entraîne l'apparition d'un œdème alvéolaire et l'échange de gaz compromis et est une caractéristique majeure de lésion pulmonaire aiguë (ALI) 1-3. Ainsi, les estimations de la perméabilité vasculaire sont importantes pour définir l'étendue des lésions pulmonaires et l'efficacité des interventions thérapeutiques proposées. Analyse gravimétrique comme le sang poumon libre rapport humide à sec et le coefficient de filtration microvasculaire sont largement utilisés méthodes pour estimer la perméabilité 4,5. D'autres procédés comprennent la quantification de la rétention de sondes radioactives ou fluorescentes dans le tissu du poumon 8.6. Cependant, les procédés ci-dessus nécessitent un traitement postexperiment d'échantillons de tissus pulmonaires vers l'élucidation des données de perméabilité. En outre, depuis un animal peut être utilisé pour un protocole de traitement unique, un grand nombre d'animaux peuvent être nécessaires pour une étude complète. Une caractéristique commune de ces méthodes est qu'elles déterminent la perméabilité vasculaire moyen pourtous les vaisseaux sanguins au sein de l'échantillon de tissu. Toutefois, il est bien établi que les micro-et macro-vaisseaux pulmonaires sont phénotypiquement différentes 9. Par conséquent, les réponses de la perméabilité peuvent être hétérogènes entre les différents segments de vaisseaux ainsi 9,10. Ainsi, la quantification de la perméabilité moyenne de tous les vaisseaux pulmonaires dans un échantillon de tissu peut ne pas refléter adéquatement cette hétérogénéité.
Dans la préparation des poumons dans le sang perfusé isolé, les vaisseaux sanguins à la surface du poumon peuvent être visualisées par un microscope droit 4,11,12. Cela permet réponses caractérisant dans les vaisseaux uniques et donc, aborder toute hétérogénéité dans les réponses 13. En outre, en utilisant l'imagerie de fluorescence des microvaisseaux, à base de fluorescence analyses peuvent être incorporés. De plus, un micro-cathéter auriculaire gauche peut être utilisé pour délivrer des agents et des sondes de fluorescence dans les vaisseaux sanguins 11,14. Microcathéter limite la livraison à une petite région du poumon, ainsi exposant seulement les vaisseaux sanguins dans la région des agents infusées et des fluorophores. Cela permet à plusieurs petites régions d'un même poumon à être utilisés pour des expériences séparées, conduisant à une réduction globale des animaux nécessaires pour une étude.
Imagerie en temps réel permet la capture de l'évolution dynamique vasculaire et fluorescence extravasculaire des microvaisseaux uniques de la préparation du poumon isolé. Ainsi, pour chaque microvaisseaux dans un champ d'image, les changements de fluorescence au cours de la perfusion de fluorophores et lessivage peuvent être enregistrées, et quantifiés en ligne 14. L'utilisation de valeurs de fluorescence maximale et résiduelle vasculaire, un indice de perméabilité pour chaque microvaisseaux dans le domaine de formation d'image peut être déterminé. Pour déterminer les changements de perméabilité en réponse à des agents anti-inflammatoires ou dommageables, l'agent désiré peut être administré en premier, puis l'indice de perméabilité déterminée. En outre, le champ d'image peut être réglée à l'intérieur de la région des poumons infusée par l'microcathéter, ce qui permet un degré élevé de flexibilité dans le choix du réseau vasculaire souhaitée. Ainsi, la préparation du poumon isolé perfusé de sang en tandem avec une imagerie en temps réel fournit un modèle expérimental attrayant pour quantifier la perméabilité dans les microvaisseaux pulmonaires uniques.
Protocol
Representative Results
Discussion
La préparation du poumon sang perfusé isolé couplé avec l'imagerie en temps réel fournit un outil simple pour la détermination des changements de perméabilité dans les microvaisseaux pulmonaires simples. Nous avons appliqué cette méthode pour définir les changements de perméabilité en réponse aux perfusions de LPS. Nos données indiquent clairement que l'infusion de LPS a provoqué une augmentation de la perméabilité microvasculaire. En outre, les données indiquent également que les modificatio…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les études ont été soutenus par les NIH HL75503 à KP.
Materials
| Tygon Tubing | Fisher Scientific | #18 | |
| Pressure Transducer | Data Sciences International | P23XL | Need quantity 3 |
| Butterfly Needle | Greiner Bio-One | 450081 | 21G |
| Peristaltic pump | Cole Parmer | Masterflex L/S | |
| PE-90 tubing | Becton Dickinson | 427421 | 30 cm needed |
| PE-10 tubing | Becton Dickinson | 427401 | 40 cm needed |
| Syringe Pump | Braintree Scientific | BS8000 | |
| O-ring | Custom made with a 20 mm diamter hole and a handle to secure o-ring to holder | ||
| Upright fluorescence microscope | Olympus America | BX61WI | |
| Image Acquisition Software | Molecular Devices | Metamorph | |
| FITC Dextran 20KD | Sigma Aldrich | 0.5 mg/ml (A dextran of different molecular size can be selected, if trial experiments indicate its suitability based on the calculated permeability index values) | |
| Lipopolysaccharide | Sigma Aldrich | Serotype 0111:B4 |
Referências
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