İzole Kan-perfüze Sıçan Akciğer Hazırlık Tek Mikrodamar Geçirgenliği miktarının
Summary
İzole edilmiş perfüze akciğer kan hazırlama akciğer yüzeyindeki mikro damar ağları görselleştirmek için bu mümkün kılar. Burada, gerçek zamanlı flüoresan görüntüleme kullanılarak izole edilmiş akciğerlerde bir mikro damarların geçirgenliğini ölçmek için bir yaklaşımı tarif eder.
Abstract
İzole edilmiş perfüze akciğer kan hazırlama yaygın görselleştirmek ve tek Mikro damarların içinde sinyal tanımlamak için kullanılır. Gerçek zamanlı görüntüleme ile bu hazırlık birleştirilmesi suretiyle, bireysel akciğer kılcal geçirgenlik değişiklikleri belirlemek için mümkün olur. Bu yazıda sıçan akciğerlerini yalıtmak ve otolog kan ile bunları serpmek için gereken adımları açıklar. Sonra, küçük bir akciğer bölgeye mikrokateter yoluyla florosforlar veya ajanlar demlenmeye adımları özetlemektedir. Bu tarif edilen prosedürler kullanılarak, bakteriyel lipopolisakkarid infüzyon tepki olarak sıçan akciğer kılcal geçirgenlik artışı tespit edilmiştir. Veri Lipopolisakkarit hem venüler ve kapiller mikrovasküler kesimleri arasında sıvı sızıntısı arttığını ortaya koydu. Bu yüzden, bu yöntem, bu mümkün damar kesimleri arasında geçirgenlik cevapları karşılaştırmak ve böylece, yanıt olarak bir heterojen tanımlamak için yapar. Akciğer geçirgenliğini tanımlamak için yaygın olarak kullanılan yöntemler akciğer doku örneklerinin postprocessing gerektiren ikengerçek zamanlı görüntüleme kullanımı, bu yöntem belirgin olarak, bu gereği ortadan kaldırır. Böylece, gerçek zamanlı görüntüleme ile birlikte izole akciğer hazırlık akciğer mikrovasküler geçirgenliği belirlemek için geleneksel yöntemler üzerinde çeşitli avantajlar sunuyor, henüz geliştirmek ve uygulamak için basit bir yöntemdir.
Introduction
Akciğerlerde artmış mikrovasküler geçirgenlik alveolar ödem ve bozulmuş gaz değişimi gelişimine yol açar ve akut akciğer hasarı (ALI) 1-3 önemli bir özelliğidir. Bu nedenle, vasküler geçirgenliğin tahminleri akciğer yaralanması ve önerilen terapötik müdahalelerin etkinlik derecesinin belirlenmesinde önemlidir. Bu tür kan serbest akciğer ıslak-kuru oranı ve mikrovasküler filtrasyon katsayısı olarak Gravimetrik analiz yaygın geçirgenliği, 4,5 tahmin yöntemleri kullanılır. Diğer yöntemler, akciğer dokusu, 6-8, radyoaktif ya da floresan probları miktarının tutulmasını içerir. Bununla birlikte, yukarıdaki yöntem geçirgenliği verileri açıklık doğru Akciğer doku örneklerinin postexperiment işlem gerektirir. Bir hayvan, tek bir tedavi protokolü sadece kullanılabilir Dahası, büyük hayvan sayısı tam bir çalışma için gerekli olabilir. Yukarıdaki yöntemlerin ortak bir özelliği, için ortalama damar geçirgenliğini belirler olmasıdırdoku numunesi içindeki tüm kan damarları. Ancak, iyi pulmoner mikro ve makro-gemiler 9 fenotipik farklı olduğu kurulmuştur. Bu nedenle, geçirgenlik yanıtları hem de 9,10 çeşitli damar kesimleri arasında heterojen olabilir. Böylece, bir doku örneğinin tüm pulmoner damarların geçirgenliği ortalama miktarının yeterince bu heterojenliğini yansıtmayabilir.
İzole kan perfüze akciğer hazırlık, akciğer yüzeyinde kan damarları dik bir mikroskop 4,11,12 tarafından görüntülenmiştir olabilir. Bu tepkiler 13 herhangi bir heterojen ele böylece tek damarlarda karakterize yanıtları etkinleştirir. Buna ek olarak, mikrokapların flüoresan görüntüleme kullanılarak, floresans bazlı deneyler dahil edilebilir. Bundan başka, bir sol atriyum mikrokateter kan damarlarının 11,14 içine maddeleri ve floresan probları sunmak için de kullanılabilir. Mikrokateter küçük bir akciğer bölgeye teslim sınırlar, böylece eskiinfüzyon maddeler ve florofor için bölge içinde sadece kan damarları poz. Bu, aynı akciğer içinde birden fazla küçük bölgeler, çalışma için gerekli hayvan genel bir azalmaya yol açan, ayrı deneyler için kullanılmasına olanak verir.
Gerçek zamanlı görüntüleme vasküler ve izole akciğer hazırlanması tek mikrodamarlar ekstravasküler floresan dinamik değişiklik yakalama sağlar. Bu nedenle, bir görüntü alanı içindeki her mikrodamar için, florofor ve yıkanmasına enfüzyonu esnasında floresanstaki değişimler kaydedilmiştir ve çevrimdışı 14 belirlenebilir. Maksimum ve kalıntı damar floresans değerleri kullanarak, görüntüleme alanı içinde her mikrodamar için bir geçirgenlik dizin belirlenebilir. Iltihaplı ya da zararlı ajanlara yanıt olarak geçirgenlik değişikliklerini belirlemek için, arzu edilen ajan ilk tatbik edilebilir ve daha sonra geçirgenliği indeksi belirlenir. Buna ek olarak, görüntü alanı ile aşılanmış akciğer bölgesi içinde herhangi bir değere ayarlanabilirmikrokateter, böylece istenen damar ağı seçiminde esneklik yüksek derecede olanak tanır. Dolayısıyla, gerçek zamanlı görüntüleme ile birlikte izole edilmiş kan perfüze akciğer preparat tek akciğer Mikro damarların içinde geçirgenliği ölçmek için çekici bir deneysel model sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gerçek zamanlı görüntüleme ile birleştiğinde izole kan perfüze akciğer hazırlık tek akciğer kılcal geçirgenlik değişikliklerin belirlenmesi için basit bir araç sağlar. Bu LPS infüzyon tepki olarak geçirgenlik değişikliklerini belirlemek için bu yöntemi uygulanır. Bizim veri açıkça LPS infüzyon mikrovasküler geçirgenliği bir artışa neden olduğunu göstermektedir. Bundan başka, veriler aynı zamanda LPS ile uyarılan değişiklikler, geçirgenlik ve kılcal venüllerin hem de benzer ol…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Çalışmalar KP NIH HL75503 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Tygon Tubing | Fisher Scientific | #18 | |
| Pressure Transducer | Data Sciences International | P23XL | Need quantity 3 |
| Butterfly Needle | Greiner Bio-One | 450081 | 21G |
| Peristaltic pump | Cole Parmer | Masterflex L/S | |
| PE-90 tubing | Becton Dickinson | 427421 | 30 cm needed |
| PE-10 tubing | Becton Dickinson | 427401 | 40 cm needed |
| Syringe Pump | Braintree Scientific | BS8000 | |
| O-ring | Custom made with a 20 mm diamter hole and a handle to secure o-ring to holder | ||
| Upright fluorescence microscope | Olympus America | BX61WI | |
| Image Acquisition Software | Molecular Devices | Metamorph | |
| FITC Dextran 20KD | Sigma Aldrich | 0.5 mg/ml (A dextran of different molecular size can be selected, if trial experiments indicate its suitability based on the calculated permeability index values) | |
| Lipopolysaccharide | Sigma Aldrich | Serotype 0111:B4 |
Referências
- Ware, L. B., Matthay, M. A. The acute respiratory distress syndrome. N Engl J Med. 342, 1334-1349 (2000).
- Matthay, M. A., et al. The acute respiratory distress syndrome. J Clin Invest. 122, 2731-2740 (2012).
- Bhattacharya, J., Matthay, M. A. Regulation and repair of the alveolar-capillary barrier in acute lung injury. Annu Rev Physiol. 75, 593-615 (2013).
- Parthasarathi, K., et al. Connexin 43 mediates spread of Ca2+-dependent proinflammatory responses in lung capillaries. J Clin Invest. 116, 2193-2200 (2006).
- Parthasarathi, K., Bhattacharya, J. Localized Acid instillation by a wedged-catheter method reveals a role for vascular gap junctions in spatial expansion of Acid injury. Anat Rec (Hoboken). 294, 1585-1591 (2011).
- Gorin, A. B., Stewart, P. A. Differential permeability of endothelial and epithelial barriers to albumin flux. J Appl Physiol Respir Environ Exerc Physiol. 47, 1315-1324 (1979).
- Boutoille, D., et al. FITC-albumin as a marker for assessment of endothelial permeability in mice: comparison with 125I-albumin. Exp Lung Res. 35, 263-271 (2009).
- Thorball, N. FITC-dextran tracers in microcirculatory and permeability studies using combined fluorescence stereo microscopy, fluorescence light microscopy and electron microscopy. Histochemistry. 71, 209-233 (1981).
- Stevens, T. Functional and molecular heterogeneity of pulmonary endothelial cells. Proc Am Thorac Soc. 8, 453-457 (2011).
- Ofori-Acquah, S. F., et al. Heterogeneity of barrier function in the lung reflects diversity in endothelial cell junctions. Microvasc Res. 75, 391-402 (2008).
- Kandasamy, K., et al. Real-time imaging reveals endothelium-mediated leukocyte retention in LPS-treated lung microvessels. Microvasc Res. 83, 323-331 (2012).
- Kandasamy, K., et al. Lipopolysaccharide induces endoplasmic store Ca2+-dependent inflammatory responses in lung microvessels. PloS One. 8, (2013).
- Qiao, R. L., Bhattacharya, J. Segmental barrier properties of the pulmonary microvascular bed. J Appl Physiol. 71, 2152-2159 (1991).
- Parthasarathi, K. Endothelial connexin43 mediates acid-induced increases in pulmonary microvascular permeability. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 303, (2012).
- Wu, Y., Perlman, C. E. In situ methods for assessing alveolar mechanics. J Appl Physiol 1985. 112, 519-526 (2012).
- Kuebler, W. M., et al. A novel signaling mechanism between gas and blood compartments of the lung. Journal Clin Invest. 105, 905-913 (2000).
