Vi presenterer en enkel og effektiv protokoll for generering av menneskelige makrofager. Buffy coats behandles ved dobbelt tetthetsgradient sentrifugering og isolerte monocytter blir deretter differensiert til makrofager i Teflon-belagt cellekultur poser. Dette maksimerer macrophage avlinger og forenkler celle høsting for senere eksperimenter.
Menneskelige makrofager er involvert i en mengde patologiske prosesser som spenner fra infeksjonssykdommer til kreft. Dermed de utgjør et verdifullt verktøy for å forstå de underliggende mekanismene for disse sykdommene. Vi har derfor presentere en enkel protokoll for isolering av humane monocytter fra buffy coats, etterfulgt av en differensierings prosedyre som resulterer i høye utbytter macrophage. Teknikken er avhengig for det meste på vanlig tilgjengelig laboratorieutstyr, og dermed gir en kostnadseffektiv og tidseffektiv måte for å oppnå store mengder av humane makrofager. Kort fortalt blir buffy coats fra friske blodgivere kastes en dobbelt tetthetsgradient sentrifugering for å høste monocytter fra perifert blod. Disse monocytter dyrkes deretter i fluorerte etylen-propylen (FEP) Teflon-belagt cellekultur poser i nærvær av makrofag kolonistimulerende faktor (M-CSF). De differensierte makrofager lett kan høstes og brukes til senere studier og funksjonell somsier. Viktige metoder for kvalitetskontroll og validering av isolasjon og differensiering tiltak vil bli markert i protokollen. Oppsummert protokollen beskrevet her at forskerne kan rutinemessig og reproduserbart isolere humane makrofager uten behov for kostnadskrevende verktøy. Videre kan sykdomsmodeller bli undersøkt i en syngen humant system omgå anvendelse av murine makrofager.
Celler fra monocyttisk avstamning og deres terminalt differensierte derivative – makrofager – utviser en slående plastisitet i forhold til sin biologiske funksjon, som fører til deres engasjement i så ulike prosesser som utvikling, vev reparasjon, og immunitet en. Sistnevnte er på grunn av deres phagocytic og antigen-presentasjon evne som plasserer makrofager i skjæringspunktet mellom det medfødte og adaptive immunrespons to. Imidlertid, til deres evne utskille cytokiner, kjemokiner, vekstfaktorer og andre signalmolekyler 1 ikke bare forsterker deres immun-modulerende funksjon, men også tjener som et grunnlag for sine ytterligere funksjoner. Forsøk på å speile disse ulike aktiverings trinnene i sammenheng med ikke-mikrobielle medierte forholdene har resultert i M1 og M2 kategorier 3. Mens denne klassifiseringen er ikke komplett, gir det mulighet for en grunnleggende forståelse av makrofag biologi.
På grunn av disse mangefasetterte evner det kommer ikke som noen overraskelse at makrofager er forbundet med mange forhold som på en eller annen måte involverer vev remodeling eller betennelse. Ved siden av sin grunnleggende rolle i anerkjennelse og rydding av invaderende patogener 4-6, har makrofager i økende grad kommet i fokus i aterosklerose, fibrose, fedme og kreft 7-10. En reproduserbar metode for generering av humane makrofager er derfor av avgjørende betydning for en forståelse av disse patologier. Her presenterer vi en fremgangsmåte basert på isolering av humane monocytter fra perifert blod fra friske donorer ved en dobbelt tetthetsgradient sentrifuge teknikken som tidligere beskrevet for 11. For å lette differensiering til makrofager, blir de isolerte monocyttiske celler inkubert i nærvær av lave konsentrasjoner av M-CSF og normalt humant serum 12. For å lette videre håndtering og celle slakting blir differensiering gjennomført i gass gjennomtrengelig FEPTeflon-belagt cellekultur poser med en hydrofob overflate 12-15. De resulterende hvilende makrofager kan bli utsatt for en rekke analyser som de er fremdeles i stand til å reagere på enten en M1 eller M2-aktig måte. Alternative metoder for monocyte isolasjon og påfølgende differensiering for eksempel magnetiske aktivert celle sortering (MACS) eller motstrøms sentrifugal elueringstid (CCE) har noen begrensninger når det gjelder avkastning, kostnader og tid som kreves. Protokollen beskrevet heri har den fordelen at den kan bli utført med standard laboratorieutstyr uten behov for spesielle reagenser (f.eks MACS magnetiske kuler) eller enheter (f.eks, CCE apparater), og gjør det mulig for behandling av store mengder celler.
Makrofager er viktige effektorceller av den medfødte immunsystemet, og viser viktige funksjoner i immunomodulering, antigen presentasjon og vev homeostase. På grunn av deres bemerkelsesverdige plastisitet, er de i stand til å reagere på forskjellige stimuli med endring av deres fenotype. Men er så langt en masse data om makrofag polarisering oppnådd i murine system, selv om det finnes rapporter som viser at bare rundt 50% av makrofager polarisering markører kan være direkte oversatt fra mus til menneske 16. Derfor presenterer vi her en metode for å oppnå primære humane makrofager i tilstrekkelig antall og renhet uten behov for kostbare materialer, f.eks MACS magnetiske perler eller en motstrøm sentrifugal elueringstid enhet.
Metoden er basert på isolering av monocytter fra PBMC og deres påfølgende differensiering til makrofager i FEP Teflon-belagt cellekultur poser i nærvær av lave concentrations av M-CSF 11-13. Mens monocytter utgjør mindre enn 5 til 10% av perifert blod leukocytter hos mennesker, ved stimulering de rekrutteres til perifere områder der de skiller til beboe vevsmakrofager eller dendrittiske celler 17. Cytokin M-CSF er viktig for monocyte overlevelse og driver deres differensiering til makrofager 18,19. Så langt har M-CSF-konsentrasjoner som ble valgt for monocytt differensiering varierte opp til 100 ng / ml, men i vår protokoll er vi i stand til å skaffe et tilstrekkelig antall modne makrofager med en M-CSF-konsentrasjon på bare 2,5 ng / ml 12 20. I tillegg, dyrkes cellene i FEP Teflon-belagte cellekultur poser som letter løsgjøring av makrofager og deres påfølgende såing i definerte celleantall. Siden posene kan brukes om igjen flere ganger, reduseres denne ytterligere kostnader for isoleringsprosessen.
De makrofager oppnådd med denne prosedyrener svært positive for CD45, CD14, CD11b, CD11c og vis uttrykk for mannose reseptor CD206 som argumenterer for en befolkning på rene, modne makrofager 21,22. Spesielt høye CD14 ekspresjon er typisk for makrofager differensiert i nærvær av M-CSF 23. Etter såing av cellene, viser de en rask tilslutning til plastoverflater med noen celler som viser en typisk spindel-lignende morfologi, mens andre fremvise en stekt egg fenotype. Dette er i samsvar med observasjoner fra andre forfattere 18,22,24.
Det ble rapportert at monocytt differensiering i nærvær av M-CSF fører til M2-polariserte makrofager 16,25. Imidlertid, makrofager isolert ved vår protokoll er fortsatt i stand til å svare på et bredt spekter av stimuli, inkludert eksponering av tumorcelleavledet mikrovesikler og ko-kultur med tumorceller 26,27 eller eksponering overfor LPS som de reagerer med induksjon av pro- inflammatoriske gener som for eksempel IL-1 &# 946 ;, TNF-alfa, Wnt5a, eller ulike matriksmetalloproteinaser som anses typisk for M1-polariserte makrofager 3,5,28.
Som konklusjon, isolering av monocytter etter dobbelt tetthetsgradient sentrifugering og påfølgende differensiering til makrofager i FEP Teflon-belagte cellekultur poser fører til et høyt antall makrofager uten behov for teknisk vanskelige eller kostbare fremgangsmåter. De oppnådde makrofager kan utnyttes for påfølgende analyse som strekker seg fra klassiske aktivering gjennom LPS til ko-kulturen med tumorceller.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å takke Mrs. Meike Schaffrinski for henne alltid utmerket teknisk assistanse i løpet av de siste årene.
Dette arbeidet ble finansiert gjennom den tyske Research Council (DFG) innenfor den felles forskningsgruppe 942 (FOR942) og ved Research Program for Det medisinske fakultet, Georg-August-universitetet Göttingen.
antibodies for immunophenotyping | Beckman Coulter | for example: CD11c-PE (IM1760), CD45-FITC (7782), IgG1-PE isotype control (A07796), IgG1-FITC isotype control (A07795) | |
BioLegends | for example: CD14-FITC (325603), CD206-PE (321105) | ||
Axiovert 200M microscope | Zeiss | ||
calcein-AM | AnaSpec | 89201 | |
combi-stopper closing cones | Braun | 4495101 | |
1x PBS, w/o Ca and Mg | Pan biotech | P04-36500 | for PBS-EDTA (1 mM) add 1 ml 0,5 M EDTA per 500ml PBS |
10x PBS, w/o Ca and Mg | Invitrogen | 14200-067 | |
EDTA (Titriplex III) | Merck | 1084211000 | prepare a 0,5 M solution in H2O, use a sterile filter |
cell dissociation buffer (enzyme-free, PBS-based) | Gibco | 13151-014 | |
Fetal calf serum (FCS) | Invitrogen | 10091148 | heat-inactivated |
Ficoll (density 1.077g/ml) | Biochrom AG | L6115 | |
FACSCanto II | BD Biosciences | ||
goat anti-mouse FITC | santa cruz | sc-2010 | |
LPS from E.coli | Sigma | L8274 | final conc: 100 ng/ml |
Multifuge 3 L-R | Heraeus | ||
Penicillin/streptomycin | Biochrom AG | A2213 | |
Percoll (density 1,131g/ml) | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
Perfusor syringe 50ml | Braun | 8728844F | |
Phalloidin-TRITC | Sigma | P1951 | resuspend in methanol (c = 0,1 mg/ml) |
Plastic Disposable Pasteur Pipettes | LVL technologies | 2655181 | |
rh M-CSF | ImmunoTools | 11343117 | Resuspend in 500µl sterile H2O (c = 100 ng/µl), aliquot |
RPMI-1640 with Phenol Red | Gibco | 21875-034 | |
RPMI-1640 without Phenol Red | Gibco | 11835-063 | |
sterilization paper | VP group | 3KFKFS230116 | |
Trypan Blue stain (0,4% w/v) | Sigma | T8154 | |
FEP Teflon-coated cell culture bag, small | CellGenix | 72-C | |
FEP Teflon-coated cell culture bag, large | CellGenix | 197-C |