Acuta cerebrale Trauma nei topi Seguito By longitudinale a due fotoni di imaging
Summary
Trauma acuto cerebrale è una lesione grave che non ha alcun trattamento adeguato ad oggi. La microscopia multiphoton permette lo studio longitudinalmente il processo di sviluppo acuto trauma cerebrale e sondando strategie terapeutiche nei roditori. Due modelli di trauma cerebrale acuto studiato con in vivo a due fotoni di imaging del cervello sono dimostrate in questo protocollo.
Abstract
Anche se trauma cerebrale acuto spesso deriva da danni testa in diversi incidenti e colpisce una frazione consistente della popolazione, non vi è ancora alcun trattamento efficace per esso. Limiti dei modelli animali attualmente utilizzati impedire la comprensione del meccanismo patologia. La microscopia multiphoton permette di studiare cellule e tessuti all'interno cervelli animali intatti longitudinalmente in condizioni fisiologiche e patologiche. Qui, descriviamo due modelli di danno cerebrale acuto studiati per mezzo di due fotoni di imaging del comportamento delle cellule cerebrali in condizioni post-traumatiche. Una regione del cervello selezionata è ferito con un ago appuntito per produrre un trauma di larghezza controllato e profondità nel parenchima cerebrale. Il nostro metodo utilizza puntura stereotassica con un ago da siringa, che può essere combinato con l'applicazione simultanea della droga. Proponiamo che questo metodo può essere utilizzato come uno strumento avanzato per studiare i meccanismi cellulari di conseguenze fisiopatologiche di trauma acuto nel cervello dei mammiferi <em> In vivo. In questo video, uniamo danno cerebrale acuto con due preparazioni: cranica finestra e cranio diradamento. Discutiamo anche vantaggi ei limiti di entrambe le preparazioni per multisessione l'imaging della rigenerazione cerebrale dopo un trauma.
Introduction
Lesione cerebrale acuta è un problema rilevante di sanità pubblica, con alta incidenza di lesioni in incidenti automobilistici, cadute o aggressioni, e l'alta prevalenza di una successiva disabilità cronica. Approcci terapeutici per il trattamento di lesioni cerebrali rimangono del tutto sintomatico, limitando così l'efficacia del trattamento preospedaliero, chirurgica e critica. Questo rende l'impatto sociale ed economico delle lesioni cerebrali particolarmente grave. Per una serie di ragioni, la maggior parte degli studi clinici non hanno dimostrato un miglioramento nel recupero dopo lesione cerebrale utilizzando approcci terapeutici.
I modelli animali sono fondamentali per lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche nei confronti di una fase in cui l'efficacia dei farmaci può essere previsto in pazienti con lesioni cerebrali. Allo stato attuale, esistono diversi modelli animali ben consolidata di trauma cranico, compreso l'impatto controllato corticale 1, lesioni percussioni fluido 2, dinamico deformazione corticale 3, peso-drop4, e lesioni foto 5. Un certo numero di modelli sperimentali sono stati utilizzati per studiare alcuni aspetti morfologici, molecolari e comportamentali del trauma cranico associata patologia. Tuttavia, nessun singolo modello animale è del tutto riuscito a convalidare nuove strategie terapeutiche. Sviluppo di modelli animali affidabili, riproducibili e controllate di lesioni cerebrali è necessario valutare i processi patologici complessi.
Il romanzo combinazione delle più recenti tecnologie di imaging microscopici e reporter fluorescenti geneticamente codificati offre un'opportunità senza precedenti per studiare tutte le fasi di lesioni cerebrali, tra cui lesione primaria, diffusione della lesione primaria, lesione secondaria, e la rigenerazione. In particolare, in vivo microscopia a due fotoni è una tecnologia ottica non lineare unica che permette la visualizzazione in tempo reale delle strutture cellulari e subcellulari anche in strati profondi corticali del cervello dei roditori. Diversi tipi di cellule e organelles possono essere esposte contemporaneamente combinando marcatori fluorescenti differenti. L'utilizzo di questo potente strumento, possiamo visualizzare i cambiamenti morfologici e funzionali dinamici nel cervello di vivere in condizioni post-traumatiche. I vantaggi di in vivo microscopia a due fotoni nello studio di lesioni cerebrali sono stati recentemente dimostrati da Kirov e colleghi 6. Utilizzando un modello di focale contusione corticale mite, questi autori hanno dimostrato che lesioni dendritiche acuto nella corteccia pericontusional è recintato dalla diminuzione del flusso sanguigno locale. Inoltre, hanno dimostrato che la corteccia metabolicamente compromesso attorno al sito contusione è ulteriormente danneggiato dalla depolarizzazione diffusione. Questo danno secondario riguarda circuiti sinaptici, rendendo le conseguenze di lesioni cerebrali traumatiche più gravi.
Qui, proponiamo il metodo di puntura stereotassico con una siringa con ago, che può essere combinato con applicazione simultanea farmaco topico, come un modello avanzato per cervello localelesioni e come strumento per studiare le conseguenze fisiopatologiche del trauma acuto nel cervello dei mammiferi in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Trauma cerebrale è un evento imprevedibile brusco. Qui, descriviamo il modello animale che riproduce uno spettro di alterazioni patologiche osservate nei pazienti umani dopo lesione cerebrale come neurodegenerazione, eliminazione di dendriti, edema cerebrale, cicatrice gliale, emorragie nella corteccia cerebrale focale accoppiato con emorragia subaracnoidea e aumentata permeabilità della barriera emato-encefalica. Per studiare la patogenesi primaria e secondaria, nonché il recupero dopo un trauma, questo modello preg…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Siamo profondamente grati al Dr. Frank Kirchhoff per la fornitura di GFAP-EGFP e ceppi di topi CX3CR1-EGFP. Il lavoro è stato sostenuto da finanziamenti del Centro di Mobilità Internazionale della Finlandia, Tekes, finlandese Graduate School of Neuroscience (FGSN) e l'Accademia di Finlandia.
Materials
| 2A-sa dumb Tweezers, 115mm | XYtronic | XY-2A-SA | |
| 30G ½’’ needle | BD | REF 304000 | |
| Animal trimmer, shaving machine | Aesculap | Isis GT420 | |
| Binocular Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Biological Temperature Controller with stainless steel heating pad | Supertech | TMP-5b | |
| Blunt microsurgical blade | BD | REF 374769 | |
| Borosilicate tube with filament | Sutter Instruments | BF120-69-10 | For glass pipette production |
| Carprofene | Pfizer | Rimadyl vet | |
| Chlorhexidine digluconate | Sigma | C9394 | |
| Dental cement | DrguDent, Dentsply | REF 640 200 271 | |
| Dexamethasone | FaunaPharma | Rapidexon vet | |
| Disposable drills | Meisinger | HP 310 104 001 001 008 | |
| Dulbeco’s PBS 10X | Sigma | D1408 | |
| Dumont #5 forceps, 110 mm | FST | 91150-20 | |
| Ealing microelectrode puller | Ealing | 50-2013 | Vertical puller for glass pipette production |
| Eyes-ointment | Novartis | Viscotears | |
| Foredom drill control | Foredom | FM3545 | |
| Foredom micro motor handpiece | Foredom | MH-145 | |
| Gas anesthesia platform for mice | Stoelting | 50264 | Assembled on stereotaxic instrument |
| Hemostasis Collagen Sponge | Avitene, Ultrafoam BARD | Ref 1050050 | |
| Imaris | Bitplane | ||
| Ketamine | Intervet | Ketaminol vet | |
| Mai Tai DeepSee laser | Spectra-Physics | ||
| Metal holder | Neurotar | ||
| Micro dressing forceps, 105 mm | Aesculap | BD302R | |
| Microfil | WPI | MF34G-5 | Micro syringe filling capillaries |
| Mineral oil | Sigma | M8410 | |
| Multiphoton Laser Scanning Microscope | Olympus | FV1000MPE | |
| NanoFil Syringe 10 microliter | WPI | NANOFIL | Hamilton syringe |
| Nonwoven swabs 5×5 | Molnlycke Health Care | Mesoft | Surgical tampons |
| polyacrylic glue | Henkel | Loctite 401 | |
| Round glass coverslip | Electron Microscopy Sciences | ||
| 1.5 thickness | |||
| Small animal stereotaxic instrument | David Kopf Instruments | 900 | |
| Stoelting mouse and neonatal rat adaptor | Stoelting | 51625 | Assembled on stereotaxic instrument. |
| Student iris scissors, straight 11.5 cm | FST | 91460-11 | |
| Sulforhodamine 101 | Molecular Probes | S-359 | |
| UMP3 microsyringe pump and Micro 4 microsyringe pump controller | WPI | UMP3-1 | Microinjector and controller |
| Xylazine | Bayer Health Care | Rompun vet |
Referências
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