Automated Análise de Ca dinâmico 2 + Sinais em seqüências de imagens

Summary

Aqui um romance região do protocolo de análise de juros com base na classificação elipses melhor ajuste atribuídos a regiões de sinal positivo dentro de sequências de imagens de lapso de tempo bidimensional é demonstrada. Este algoritmo pode permitir que os investigadores a analisar exaustivamente sinais fisiológicos Ca ^{+ 2} com entrada mínima do usuário e preconceito.

Abstract

Ca ^{2 +} intracelular sinais são vulgarmente estudada com corantes de Ca ^{2 +} indicadoras fluorescentes e as técnicas de microscopia. No entanto, a análise quantitativa de Ca ^{2 +} dados de imagem é demorado e sujeito a viés. Algoritmos de análise de sinal automatizado baseado na região de interesse (ROI) de detecção têm sido implementadas para medições de varredura de linha unidimensional, mas não há nenhum algoritmo atual que integra a identificação otimizado e análise de ROI em sequências de imagens bidimensionais. Aqui um algoritmo para rápida aquisição e análise de ROI em sequências de imagens é descrito. Ele utiliza elipses caber aos sinais filtrados de ruído, a fim de determinar a colocação ROI ideal, e calcula Ca ^{2 +} parâmetros do sinal de amplitude, duração e distribuição espacial. Este algoritmo foi implementado como um plug-in gratuito para software ImageJ (NIH). Juntamente com os scripts de análise escritos para o open source software de processamento estatístico R,Esta abordagem proporciona um gasoduto de alta capacidade para a realização de análise estatística rápida da produção experimental. Os autores sugerem que o uso deste protocolo de análise levará a uma caracterização mais completa e imparcial do fisiológica Ca ^{2 +} de sinalização.

Introduction

Ca ^{2 +} é um segundo mensageiro ubíquo molécula sinalizadora e citosólicas de ^{Ca2 +} níveis são altamente regulamentados. Ca ^{2 +} intracelular sinais são complexas e incluem transientes isoladas, oscilações, e as ondas de propagação ^1-4. Controle espacial e temporal da Ca ^{2 +} é pensado para ser a base especificidade sinal fisiológico e, portanto, a análise de Ca ^{2 +} padrões de sinal é de considerável interesse para os investigadores em vários campos ^5.

Corantes de Ca ^{2 +,} como indicador de Fluo-4 e de Fura-2 são normalmente utilizados para medir intracelu....

Protocol

1. Dissection Vessel and Imaging

1. Tecido Colheita de suínos juvenis domésticos, conforme descrito no Martens et al ^27. Coloque ventrículos direito suínos colhidas em um polidimetilsiloxano (PDMS) prato dissecção inferior contendo tampão HEPES solução salina fisiológica (PSS).
   1. Com o auxílio de um microscópio estereoscópico, dissecar e remover um segmento da artéria coronária descendente anterior da artéria coronária (~ 8 milímetros de comprimento, 0,5 mm de diâmetro) de tecido circundante, utilizando um fórceps e tesouras mola através da remoção do segmento de vaso a partir das camadas de tecido cardíaco circundantes. NOTA: Tome ....

Results

Um algoritmo de costume, LC_Pro, foi desenvolvido e implementado, a fim de realizar a análise automatizada de Ca ^{2 +} dinâmicas em sequências de imagem confocal. Como representado na Figura 1, o algoritmo utiliza módulos de processamento sequenciais que A) detectar e locais de pista de dinâmica de Ca ^{2 +} mudar acima estatística (p <0,01) o ruído, B) definir as regiões de interesse (ROI) automaticamente em centros de sítio activo, e C) calcular intensidades médias de fluorescência.......

Discussion

Decodificando complexos Ca ^{2 +} sinais a nível celular e multicelular exigirá abordagens experimentais e analíticos rigorosos. Aqui, é descrito um método em que a sequência de tempo de imagem confocal resolvidos de Ca ^{2 +} dependente de fluorescência são submetidas a uma análise automatizado que identifica e quantifica a Ca ^{2 +} sinais estatisticamente relevantes dentro de campos celulares intactos no caso concreto apresentado, um segmento da artéria foi isolado de coração de porco, preso a.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Prato de dissecação	Fisher Sci	# 08-772-70
Polidimetilsiloxano (PDMS)	Fisher Sci	#NC9644388	kit de elastômero, deve ser moldado em pratos
com buffer HEPES PSS	Sigma	#H3375-250G	HEPES ácido
Estereomicroscópio	Nikon Inst.
Fórceps	Fine Science Tools	# 11223-20
Tesoura de mola	Fine Science Tools	15003-08
Fio de tungstênio	Scientific Inst Svcs	# 406
Fluo-4 AM	Life Tech.	#F-14201
Pluronic F-127	Life Tech.
Pinos de metal	Fine Science Tools	#26002-10
Câmara			de
Microscópio confocal de disco giratório	Perkin Elmer	RS-3
ImageJ software			download em: http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html
LC_Pro plugin para imageJ			download em: http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lc-pro/index.html
R software			baixe em: http://www.r-project.org/
		de plotagem de rastreamento R	baixe em: https://docs.google.com/file/d/0B-PSp1D9e2fjV3NIcGppUzkxdEk/edit?usp=sharing