Geautomatiseerde analyse van Dynamic Ca<sup> 2 +</sup> Signalen in reeksen afbeeldingen
Summary
Hier een nieuwe regio van belang analyse protocol gebaseerd op het sorteren van best-fit ellipsen toegewezen aan regio's positief signaal binnen twee-dimensionale time beeld lapse sequenties wordt aangetoond. Dit algoritme kan onderzoekers in staat te stellen volledig kunnen onderzoeken fysiologische Ca 2 +-signalen met een minimale input van de gebruiker en vooringenomenheid.
Abstract
Intracellulaire Ca2 + signalen worden vaak bestudeerd fluorescente Ca2 + indicator kleurstoffen en microscopische technieken. Echter, kwantitatieve analyse van Ca 2 + beeldgegevens is tijdrovend en onder voorspanning. Geautomatiseerde signaalanalyse algoritmes gebaseerd op de regio van belang (ROI) detectie is geïmplementeerd voor een-dimensionale lijn scan metingen, maar er is geen stroom algoritme dat geoptimaliseerd identificatie en analyse van ROI in twee-dimensionaal beeld sequenties integreert. Hier een algoritme voor snelle acquisitie en analyse van ROI in beeld sequenties wordt beschreven. Het maakt gebruik van ellipsen passen aan lawaai gefilterde signalen om een optimale ROI plaatsing bepalen en berekent Ca 2 +-signaal parameters van amplitude, duur en ruimtelijke spreiding. Dit algoritme werd geïmplementeerd als een vrij beschikbare plugin voor ImageJ (NIH) software. Samen met analyse scripts geschreven voor de open source statistische verwerking software R,Deze aanpak zorgt voor een hoge capaciteit pijpleiding voor het uitvoeren van snelle statistische analyse van de output. De auteurs suggereren dat het gebruik van deze analyse protocol leidt tot een meer volledige en onpartijdige karakterisering van fysiologische Ca2 +-signalen.
Introduction
Ca 2 + is een alomtegenwoordige tweede boodschapper signalering molecuul en cytosolische Ca 2 + niveaus zijn sterk gereguleerd. Intracellulaire Ca 2 +-signalen zijn complex en omvatten geïsoleerde transiënten, trillingen en golven propageren 1-4. Ruimtelijke en tijdelijke besturing van Ca2 + wordt gedacht fysiologische signaal specificiteit ten grondslag liggen, en derhalve de analyse van Ca2 + signaal patronen van groot belang voor onderzoekers in meerdere velden 5.
Ca 2 +-indicator kleurstoffen zoals Fluo-4 en Fura-2 worden gewoonlijk gebruikt om intracellulaire Ca2 +-signalen meten met fluorescentiemicroscopie 5-12. Meestal worden tijdelijke Ca 2 +-signalen geëvalueerd als tijdsafhankelijke veranderingen in de gemiddelde fluorescentie binnen een door de gebruiker gedefinieerde gebied of regio van belang (ROI) 5,6,13 – 16. Momenteel handmatige ROI-analyse is zowel tijdrovend en arbeidsintensief inSpannend, want het vereist dat gebruikers veel ROI's te identificeren en uit te voeren repetitieve berekeningen 17-19. Deze technieken kunnen ook onderhevig zijn aan aanzienlijke fouten van gebruikers, met inbegrip van de invoering van kunstmatige signaal modes en uitsluiting van lage amplitude of diffuse signalen 18,20.
Geautomatiseerde ROI detectie algoritmen eerder zijn uitgevoerd met verschillende statistische benaderingen optimale ROI plaatsing bepalen, maar over het algemeen beperkt tot de analyse van lijn scan of pseudo-line scans, die analyse beperkt tot een ruimtelijke dimensie tijd 17 19-22. Daarnaast hebben veel bestaande algoritmen niet toereikend zijn om de diversiteit van de Ca 2 + gebeurtenissen release die variëren van periodieke, gelokaliseerde transiënten op teeltmateriaal golven 23,24 omvatten. Uitgebreide evaluatie van fysiologische Ca 2 +-signalen wordt vaak verder gecompliceerd door de aanwezigheid van aanzienlijke image artifhandelen die verwart signaal om discriminatie ruis in veel experimentele systemen.
Voorheen, een geautomatiseerde ROI algoritme oplossing Ca2 + signaal transiëntdetectie, uitgevoerd als een plugin voor NIH ImageJ software (National Institutes of Health, Bethesda, MD), werd ontwikkeld en gevalideerd 25,26. Dit algoritme, genaamd LC_Pro, werd ontworpen om ROI allesomvattende Ca 2 + transiënten signaal in twee-dimensionale time lapse beeld sequenties te identificeren en te analyseren. Hier een praktische experimentele protocol en representatieve demonstratie van een toepassing van het algoritme in varkens coronaire endotheel is voorzien, met extra postprocessing met behulp van de open source statistische verwerking software R bruikbare grafische output te genereren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Decoderen van complexe Ca 2 +-signalen op cellulair en meercellige niveau strenge experimentele en analytische benaderingen vereisen. Hier wordt een aanpak beschreven waarin tijdsopgeloste beeld confocale sequenties van Ca2 +-afhankelijke fluorescentie worden onderworpen aan een geautomatiseerde analyse die statistisch relevante Ca2 + signalen in intacte cellulaire domeinen In het specifieke geval gepresenteerd identificeert en kwantificeert, een slagader segment geïsoleerd van varken h…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd mede ondersteund door de National Institutes of Health Grants HL-085887, HL-092992, S10RR027535 en MOP-93676.
Materials
| dissection dish | Fisher Sci | #08-772-70 | |
| polydimethylsiloxane (PDMS) | Fisher Sci | #NC9644388 | elastomer kit, must be molded into dishes |
| HEPES-buffered PSS | Sigma | #H3375-250G | HEPES acid |
| stereomicroscope | Nikon Inst. | #MNA42000 | |
| forceps | Fine Science Tools | #11223-20 | |
| spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| tungsten wire | Scientific Inst Svcs | #406 | |
| Fluo-4 AM | Life Tech. | #F-14201 | |
| pluronic F-127 | Life Tech. | #P3000MP | |
| metal pins | Fine Science Tools | #26002-10 | |
| cover-glass bottom chamber | Custom designed | ||
| spinning disc confocal microscope | Perkin Elmer | RS-3 | |
| imageJ software | download at: http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html | ||
| LC_Pro plugin for imageJ | download at: http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lc-pro/index.html | ||
| R software | download at: http://www.r-project.org/ | ||
| R traceplot script | download at: https://docs.google.com/file/d/0B-PSp1D9e2fjV3NIcGppUzkxdEk/edit?usp=sharing |
Referências
- Berridge, M. J. Inositol trisphosphate and calcium signalling. Nature. 361 (6410), 315-325 (1993).
- Berridge, M. J., et al. The versatility and universality of calcium signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).
- Delisle, S. The four dimensions of calcium signalling in Xenopus oocytes. Cell Calcium. 12 (2-3), 217-227 (1991).
- Dupont, G., et al. Calcium dynamics: spatio-temporal organization from the subcellular to the organ level. Int Rev Cytol. 261, 193-245 (2007).
- Hayashi, H., Miyata, H. Fluorescence imaging of intracellular Ca2. J Pharmacol Toxicol Methods. 31 (1), 1-10 (1994).
- Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM. J Vis Exp. 23, (2009).
- Hong, J. H., et al. Intracellular calcium spikes in rat suprachiasmatic nucleus neurons induced by BAPTA-based calcium dyes. PloS One. 5 (3), (2010).
- Kuga, N., et al. Large-scale calcium waves traveling through astrocytic networks in vivo. J Neurosci. 31 (7), 2607-2614 (2011).
- Mumtaz, S., et al. The mechanism of agonist induced Ca2+ signalling in intact endothelial cells studied confocally in in situ arteries. Cell Calcium. 49 (1), 66-77 (2011).
- Paredes, R. M., et al. Chemical calcium indicators. Methods. 46 (3), 143-151 (2008).
- Silei, V., et al. Measurement of intracellular calcium levels by the fluorescent Ca2+ indicator Calcium-Green. Brain Res Brain Res Protoc. 5 (2), 132-134 (2000).
- Simpson, A. M. Fluorescent measurement of [Ca2+]c: basic practical considerations. Methods Mol Biol. 937, 3-36 (2006).
- Gaspers, L. D., Thomas, A. P. Calcium signaling in liver. Cell Calcium. (3-4), 329-342 (2005).
- Hellman, B., et al. Cytoplasmic Ca2+ oscillations in pancreatic ß-cells. Biochem Biophys Acta. 1113 (3-4), 295-305 (1992).
- Kansui, Y., et al. Enhanced spontaneous Ca2+ events in endothelial cells reflect signalling through myoendothelial gap junctions in pressurized mesenteric arteries. Cell Calcium. 44 (2), 135-146 (2008).
- Tatsumi, H., et al. Measurement of the intracellular calcium concentration in guinea-pig myenteric neurons by using fura-2. Brain res. 451 (1-2), 371-375 (1988).
- Lorenz, J. J., et al. Pixel-based criteria-oriented analysis of time-lapse Ca2+-fluorescence images. J Neurosci Meth. 127 (2), 157-166 (2003).
- Mukamel, E. A., et al. Automated analysis of cellular signals from large-scale calcium imaging data. Neuron. 63 (6), 747-760 (2009).
- Reidl, J., et al. Independent component analysis of high-resolution imaging data identifies distinct functional domains. Neuroimage. 34 (1), 94-108 (2007).
- Wegner, F., et al. Automated detection of elementary calcium release events using the á trous wavelet transform. Biophys J. 90 (6), 2151-2163 (2006).
- Cheng, H., et al. Amplitude distribution of calcium sparks in confocal images: theory and studies with an automatic detection method. Biophys J. 76 (2), 606-617 (1999).
- Picht, E., et al. SparkMaster: automated calcium spark analysis with ImageJ. Am J Physiol Cell Physiol. 293 (3), (2007).
- Abramoff, M. D., et al. Image processing with ImageJ. Biophoton Int. 11, 36-42 (2004).
- Francis, M., et al. Automated region of interest analysis of dynamic Ca2+ signals in image sequences. Am J Physiol Cell Physiol. 303 (3), (2012).
- Qian, X., et al. Recruitment of dynamic endothelial Ca2+ signals by the TRPA1 channel activator AITC in rat cerebral arteries. Microcirculation. 20 (2), 138-148 (2013).
- Taylor, M. S., et al. Dynamic Ca2+ signal modalities in the vascular endothelium. Microcirculation. 19 (5), 423-429 (2012).
- Martens, C. J., et al. Mucous solids and liquid secretion by airways: studies with normal pig, cystic fibrosis human, and non-cystic fibrosis human bronchi. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 301 (2), (2011).
