ניתוח האוטומטי של דינמי Ca^{2 +} אותות ברצפי תמונות

Summary

הנה אזור רומן של פרוטוקול ניתוח ריבית המבוססת על מיון אליפסות מיטבית הוקצו לאזורים של אות חיובית בתוך רצפי זמן לשגות תמונה דו ממדי מודגם. אלגוריתם זה עשוי לאפשר לחוקרים לנתח באופן מקיף אותות פיסיולוגיים ⁺ Ca ² עם קלט משתמש מינימאלי ומשוא פנים.

Abstract

תאיים Ca ^{2 +} אותות נלמדים בדרך כלל עם צבעי Ca ^{2 +} חיווי ניאון ושיטות מיקרוסקופיה. עם זאת, ניתוח כמותי של Ca ^{2 +} נתוני הדמיה הוא זמן רב ובכפוף למשוא פנים. אלגוריתמי ניתוח אותות אוטומטיים המבוססים על האזור של עניין גילוי (ROI) יושמו למדידות קו סריקה חד ממדי, אבל אין שום אלגוריתם הנוכחי המשלב זיהוי מותאם וניתוח של ROIs ברצפי תמונה דו ממדיים. הנה אלגוריתם לרכישה מהירה וניתוח של ROIs ברצפי תמונה מתואר. הוא מנצל אליפסות שיתאימו לאותות מסוננים רעש על מנת לקבוע את המיקום אופטימלי את ההחזר על ההשקעה, ומחשב את פרמטרי אות ^{2 +} Ca של משרעת, משך והתפשטות במרחב. אלגוריתם זה מיושם כתוסף זמין באופן חופשי לתוכנת ImageJ (NIH). יחד עם סקריפטים ניתוח נכתבו עבור R תוכנת עיבוד הסטטיסטי הקוד הפתוח,גישה זו מספקת צינור קיבולת גבוהה לביצוע ניתוחים סטטיסטיים מהירים של תפוקה ניסיונית. המחברים מראים כי שימוש בפרוטוקול ניתוח זה יוביל לאפיון של Ca ^{2 +} איתות פיזיולוגית שלם יותר ובלתי משוחד.

Introduction

Ca ^{2 +} הוא שליח שני בכל מקום איתות מולקולה וCa ^{2 +} רמות cytosolic קבועות בתקנות. תאיים Ca ^{2 +} אותות הם מורכבים וכוללים ארעיים מבודדים, תנודות ומתפשטים גלים ^{4 – 1.} שליטה במרחב ובזמן של Ca ^{2 +} הוא חשב לבסיס סגוליות אות פיזיולוגית, ולכן הניתוח של ^{2 +} דפוסי אות Ca הוא עניין רב לחוקרים בתחומים מרובים ^5.

צבעי Ca ^{2 +} מחוון כגון Fluo-4 ופורע-2 הם בדרך כלל מועסקים על מנת למדוד ^{2 +} אותות תאיים Ca עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי ^5-12. בדרך כלל, Ca ^{2 +} אותות זמן מוערכים כשינויים תלויי זמן בקרינה ממוצעת בתוך אזור המוגדר על ידי משתמש, או באזור של עניין (ROI) ^{5,6,13 – 16.} נכון לעכשיו, ניתוח ROI במדריך הוא גם זמן רב ועבודה בtensive מכיוון שהיא דורשת למשתמשים לזהות ROIs רבות ולבצע חישובים החוזרים על עצמן ^17-19. טכניקות אלו עשויות להיות כפופות גם למשתמש שגיאה ניכרת, כוללים הקדמה של מצבי אות מלאכותיים והדרה של משרעת נמוכה או אותות מפוזר ^18,20.

אלגוריתמים לזיהוי אוטומטיים את ההחזר על ההשקעה בעבר יושמו באמצעות מגוון של גישות סטטיסטיות כדי לקבוע מיקום ROI אופטימלי, אבל הם בדרך כלל היו מוגבלים לניתוח של קו סריקה או פסאודו אונליין תמונות סריקה, אשר מגבילה את הניתוח לממד מרחבי יחיד בזמן ^{17, 19-22.} בנוסף, קיימים אלגוריתמים רבים אינם מספיקים כדי להקיף את המגוון של Ca ^{2 +} אירועי שחרור אשר נעו בין ארעיים תקופתי, מקומי לגלים מתפשט ^23,24. הערכה מקיפה של ^{2 +} אותות Ca הפיסיולוגיים לעתים קרובות מסתבכת עוד יותר על ידי הנוכחות של artif תמונה המשמעותיתלפעול שמקעקעת אות לרעש באפליה רבות מערכות ניסיוניות.

בעבר, פתרון אוטומטי זיהוי ROI אלגוריתם לCa ^{2 +} אות זיהוי חולף, מיושם כתוסף לתוכנת NIH ImageJ (המכונים הלאומיים לבריאות, Bethesda, MD), פותח ומאומתים ^25,26. אלגוריתם זה, הנקרא LC_Pro, תוכנן כדי לזהות ולנתח ROIs המקיפה ארעיים ^{2 +} אות Ca ברצפי הזמן לשגות תמונה דו ממדיים. הנה פרוטוקול ניסוי מעשי והפגנת נציג יישום של האלגוריתם בהאנדותל של עורקים הכליליים חזירי מסופק, עם postprocessing נוסף באמצעות R תוכנת עיבוד הסטטיסטי בקוד הפתוח ליצירת פלט גרפי שמיש.

Protocol

1. Dissection כלי והדמיה רקמת קציר מחזירים לנוער מקומיים, כמתואר במרטנס et 27 אל. הנח חדרים תקין חזירים שנקטפו לpolydimethylsiloxane צלחת לנתיחה תחתונה המכילה HEPES נאגרו פתרון פיסיולוגי מלוח (PSS) (PDMS). <ol style=";text-align:right;direction:…

Representative Results

אלגוריתם מותאם אישית, LC_Pro, פותח ומיושם על מנת לבצע ניתוח אוטומטי של Ca 2 + דינמיקה ברצפי תמונת confocal. כמתואר באיור 1, האלגוריתם מנצל מודולים עיבוד רציפים ש) לזהות ואתרי מסלול של Ca הדינמי 2 + לשנות מעל סטטיסטי (p <0.01) רעש, B) להגדיר אזורים של עניין (ROI) באופ?…

Discussion

פענוח Ca ^{2 +} אותות מורכבים ברמה התאית ורבה תאית ידרוש גישות ניסוייות ואנליטיות קפדניים. כאן, גישה מתוארת שבזמן רצפי תמונת confocal נפתרו של Ca ^{2 +} הקרינה תלויה נתונים לניתוח אוטומטי שמזהה ומכמת Ca ^{2 +} אותות רלוונטיים מבחינה סטטיסטית בתוך שדות סלולריים ללא פגע …

Materials

dissection dish	Fisher Sci	#08-772-70
polydimethylsiloxane (PDMS)	Fisher Sci	#NC9644388	elastomer kit, must be molded into dishes
HEPES-buffered PSS	Sigma	#H3375-250G	HEPES acid
stereomicroscope	Nikon Inst.	#MNA42000
forceps	Fine Science Tools	#11223-20
spring scissors	Fine Science Tools	15003-08
tungsten wire	Scientific Inst Svcs	#406
Fluo-4 AM	Life Tech.	#F-14201
pluronic F-127	Life Tech.	#P3000MP
metal pins	Fine Science Tools	#26002-10
cover-glass bottom chamber			Custom designed
spinning disc confocal microscope	Perkin Elmer	RS-3
imageJ software			download at: http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html
LC_Pro plugin for imageJ			download at: http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lc-pro/index.html
R software			download at: http://www.r-project.org/
R traceplot script			download at: https://docs.google.com/file/d/0B-PSp1D9e2fjV3NIcGppUzkxdEk/edit?usp=sharing