Dinamik Ca Otomatik Analizi<sup> 2 +</supGörüntü Dizilerinde> Sinyaller
Summary
Burada iki boyutlu zaman atlamalı görüntü dizileri içinde olumlu sinyal bölgelerine atanan en uygun elips sıralama dayanan faiz analiz protokolünün yeni bir bölge gösterilmiştir. Bu algoritma kapsamlı az kullanıcı girişi ve önyargı ile fizyolojik Ca 2 + sinyalleri analiz müfettişleri sağlayabilir.
Abstract
Hücre içi Ca 2 + sinyalleri sık floresan Ca 2 + göstergesi boyalar ve mikroskopi teknikleri ile incelenmiştir. Bununla birlikte, Ca 2 + görüntüleme de niceliksel veri analizi, zaman alıcı ve önyargı tabidir. Ilgi (ROI) algılama bölgeye dayalı otomatik sinyal analizi algoritmaları tek boyutlu çizgi tarama ölçümleri için uygulanan olmuştur, ama iki-boyutlu görüntü dizilerinin optimize kimlik ve İB'nin analizini entegre hiçbir geçerli algoritma yoktur. Burada, resim dizilerinin hızlı elde edilmesi ve ROI analizi için bir algoritma tarif edilmektedir. Bu elips optimum ROI yerleşimini belirlemek amacıyla gürültü filtre sinyallerine uygun kullanır, ve genlik, süre ve mekansal yayılma Ca 2 + sinyal parametrelerini hesaplar. Bu algoritma ImageJ (NIH) bir yazılım için serbestçe kullanılabilir eklenti olarak hayata geçirildi. Birlikte açık kaynak istatistiksel işleme yazılım Ar için yazılmış analizi komut ile,Bu yaklaşım, deneysel çıktı hızlı istatistiksel analiz yapmak için yüksek kapasiteli bir boru hattı sağlar. Yazarlar bu analiz protokolün kullanımı fizyolojik Ca 2 + sinyal bir daha tam ve tarafsız karakterizasyonu yol açacağını göstermektedir.
Introduction
Ca 2 + molekülü ve sitozolik Ca 2 + düzeyleri yüksek regüle edilen sinyalizasyon bir yerde ikinci bir elçisidir. Hücre içi Ca 2 + sinyalleri karmaşık ve izole geçişlerini, salınımlar ve dalgalar 1 çoğaltım dahil – 4. Ca 2 + mekansal ve zamansal kontrol Fizyolojik sinyal özgüllüğünü altında yatan düşünce, ve bu nedenle Ca 2 + sinyal şekillerinin analizi birden fazla alanlarda 5 araştırmacılara büyük ilgi olduğunu.
Bu tür Flu-4 ve Fura-2 ile Ca 2 + göstergesi boyalar genel olarak 5-12 floresan mikroskobu ile hücre içi Ca2 + sinyalleri ölçmek için kullanılır. 16 – Genellikle, geçici Ca 2 + sinyalleri zamana bağımlı kullanıcı tanımlı bir alanda ortalama floresan değişiklikler, ya da ilgi bölgesi (ROI) 5,6,13 olarak değerlendirilir. Şu anda, manuel ROI analizi zaman alıcı ve emek hem de bir19 – birçok İB'leri belirlemek ve tekrarlayan hesaplamaları 17 gerçekleştirmek için kullanıcılar gerektirir çünkü da oldukça kapsamlıdır. Bu teknikler aynı zamanda yapay sinyal modları ve düşük genlikli veya yaygın sinyallerinin 18,20 dışlanma tanıtımı dahil olmak üzere, önemli kullanıcı hatası tabi olabilir.
, Otomatik ROI algılama algoritmaları önceden optimum ROI yerleşimi belirlemek için istatistiksel yaklaşımlar çeşitli kullanarak uygulanan olmuştur, ama genellikle çizgi tarama ya da sözde-line zaman 17 tek bir mekansal boyut analizi kısıtlar tarama görüntüleri analiz sınırlı olmuştur 19-22. Ayrıca, birçok mevcut algoritmaları Ca periyodik, lokalize transientler dan yayılan dalgalar 23,24 aralığında 2 + serbest olaylar çeşitliliğini kapsayacak şekilde yeterli değildir. Fizyolojik Ca 2 + sinyalleri kapsamlı değerlendirme genellikle daha önemli görüntü artif varlığı ile komplikebirçok deneysel sistemlerde gürültü ayrımcılığa sinyalini karıştıran hareket.
Daha önce, Ca otomatik ROI algılama algoritması çözüm 2 + (Sağlık, Bethesda, MD National Institutes), gelişmiş ve 25,26 valide NIH ImageJ yazılım için bir eklenti olarak uygulanan geçici algılama sinyal. LC_Pro denilen Bu algoritma, iki-boyutlu zaman atlamalı görüntü dizileri Ca 2 + sinyal geçişlerini kapsayan İB'leri tanımlamak ve analiz etmek için tasarlanmıştır. İşte pratik bir deneysel protokol ve domuz koroner arter endotelyumda algoritmanın bir uygulama temsili gösteri kullanılabilir grafik çıktısı oluşturmak için açık kaynak istatistiksel işleme yazılım Ar kullanarak ek komutlar ile sağlanır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hücresel ve çok hücreli düzeyde karmaşık Ca 2 + sinyalleri çözme titiz deneysel ve analitik yaklaşımlar gerektirir. Burada, bir yaklaşım Ca 2 + bağımlı floresans çözülmesi konfokal resim dizileri sunulan spesifik durumda sağlam hücre alanları içinde istatistiksel olarak ilgili Ca 2 + sinyalleri tespit eder ve miktarını belirler otomatik analizine tabi tutulur ve bu süre de açıklanan, bir arter kademeli bir izole edildi domuz kalbinden, tutturulmuş konfokal gö…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından kısmen desteklenen Sağlık Hibeler HL-085.887, HL-092.992, S10RR027535 ve MOP-93.676.
Materials
| dissection dish | Fisher Sci | #08-772-70 | |
| polydimethylsiloxane (PDMS) | Fisher Sci | #NC9644388 | elastomer kit, must be molded into dishes |
| HEPES-buffered PSS | Sigma | #H3375-250G | HEPES acid |
| stereomicroscope | Nikon Inst. | #MNA42000 | |
| forceps | Fine Science Tools | #11223-20 | |
| spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| tungsten wire | Scientific Inst Svcs | #406 | |
| Fluo-4 AM | Life Tech. | #F-14201 | |
| pluronic F-127 | Life Tech. | #P3000MP | |
| metal pins | Fine Science Tools | #26002-10 | |
| cover-glass bottom chamber | Custom designed | ||
| spinning disc confocal microscope | Perkin Elmer | RS-3 | |
| imageJ software | download at: http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html | ||
| LC_Pro plugin for imageJ | download at: http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lc-pro/index.html | ||
| R software | download at: http://www.r-project.org/ | ||
| R traceplot script | download at: https://docs.google.com/file/d/0B-PSp1D9e2fjV3NIcGppUzkxdEk/edit?usp=sharing |
Referências
- Berridge, M. J. Inositol trisphosphate and calcium signalling. Nature. 361 (6410), 315-325 (1993).
- Berridge, M. J., et al. The versatility and universality of calcium signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).
- Delisle, S. The four dimensions of calcium signalling in Xenopus oocytes. Cell Calcium. 12 (2-3), 217-227 (1991).
- Dupont, G., et al. Calcium dynamics: spatio-temporal organization from the subcellular to the organ level. Int Rev Cytol. 261, 193-245 (2007).
- Hayashi, H., Miyata, H. Fluorescence imaging of intracellular Ca2. J Pharmacol Toxicol Methods. 31 (1), 1-10 (1994).
- Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM. J Vis Exp. 23, (2009).
- Hong, J. H., et al. Intracellular calcium spikes in rat suprachiasmatic nucleus neurons induced by BAPTA-based calcium dyes. PloS One. 5 (3), (2010).
- Kuga, N., et al. Large-scale calcium waves traveling through astrocytic networks in vivo. J Neurosci. 31 (7), 2607-2614 (2011).
- Mumtaz, S., et al. The mechanism of agonist induced Ca2+ signalling in intact endothelial cells studied confocally in in situ arteries. Cell Calcium. 49 (1), 66-77 (2011).
- Paredes, R. M., et al. Chemical calcium indicators. Methods. 46 (3), 143-151 (2008).
- Silei, V., et al. Measurement of intracellular calcium levels by the fluorescent Ca2+ indicator Calcium-Green. Brain Res Brain Res Protoc. 5 (2), 132-134 (2000).
- Simpson, A. M. Fluorescent measurement of [Ca2+]c: basic practical considerations. Methods Mol Biol. 937, 3-36 (2006).
- Gaspers, L. D., Thomas, A. P. Calcium signaling in liver. Cell Calcium. (3-4), 329-342 (2005).
- Hellman, B., et al. Cytoplasmic Ca2+ oscillations in pancreatic ß-cells. Biochem Biophys Acta. 1113 (3-4), 295-305 (1992).
- Kansui, Y., et al. Enhanced spontaneous Ca2+ events in endothelial cells reflect signalling through myoendothelial gap junctions in pressurized mesenteric arteries. Cell Calcium. 44 (2), 135-146 (2008).
- Tatsumi, H., et al. Measurement of the intracellular calcium concentration in guinea-pig myenteric neurons by using fura-2. Brain res. 451 (1-2), 371-375 (1988).
- Lorenz, J. J., et al. Pixel-based criteria-oriented analysis of time-lapse Ca2+-fluorescence images. J Neurosci Meth. 127 (2), 157-166 (2003).
- Mukamel, E. A., et al. Automated analysis of cellular signals from large-scale calcium imaging data. Neuron. 63 (6), 747-760 (2009).
- Reidl, J., et al. Independent component analysis of high-resolution imaging data identifies distinct functional domains. Neuroimage. 34 (1), 94-108 (2007).
- Wegner, F., et al. Automated detection of elementary calcium release events using the á trous wavelet transform. Biophys J. 90 (6), 2151-2163 (2006).
- Cheng, H., et al. Amplitude distribution of calcium sparks in confocal images: theory and studies with an automatic detection method. Biophys J. 76 (2), 606-617 (1999).
- Picht, E., et al. SparkMaster: automated calcium spark analysis with ImageJ. Am J Physiol Cell Physiol. 293 (3), (2007).
- Abramoff, M. D., et al. Image processing with ImageJ. Biophoton Int. 11, 36-42 (2004).
- Francis, M., et al. Automated region of interest analysis of dynamic Ca2+ signals in image sequences. Am J Physiol Cell Physiol. 303 (3), (2012).
- Qian, X., et al. Recruitment of dynamic endothelial Ca2+ signals by the TRPA1 channel activator AITC in rat cerebral arteries. Microcirculation. 20 (2), 138-148 (2013).
- Taylor, M. S., et al. Dynamic Ca2+ signal modalities in the vascular endothelium. Microcirculation. 19 (5), 423-429 (2012).
- Martens, C. J., et al. Mucous solids and liquid secretion by airways: studies with normal pig, cystic fibrosis human, and non-cystic fibrosis human bronchi. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 301 (2), (2011).
