स्तनधारी कोशिकाओं में हीम संश्लेषण स्तर की माप
Summary
Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.
Abstract
हीम ऐसे हीमोग्लोबिन, मायोग्लोबिन और cytochromes के रूप में hemoproteins, के रूप में जाना प्रोटीन की एक विस्तृत विविधता के लिए कृत्रिम समूह के रूप में कार्य करता है। यह इस तरह के जीन प्रतिलेखन, अनुवाद, सेल भेदभाव और सेल प्रसार के रूप में विभिन्न आणविक और सेलुलर प्रक्रियाओं में शामिल है। हीम के जैवसंश्लेषण स्तरों विभिन्न ऊतकों और सेल प्रकार भर में भिन्न है और इस तरह से एनीमिया, न्यूरोपैथी और कैंसर के रूप में कोढ़ की स्थिति में बदल दिया है। इस तकनीक का उपयोग करता है [4- 14 सी] 5-aminolevulinic एसिड ([14 सी] 5-पक्षक), स्तनधारी कोशिकाओं में हीम संश्लेषण के स्तर को मापने के लिए हीम जैवसंश्लेषण मार्ग में जल्दी व्यापारियों में से एक। यह परख हीम में शामिल रेडियोधर्मिता का हीम और माप की निकासी के द्वारा पीछा [14 सी] 5-Ala के साथ कोशिकाओं के ऊष्मायन शामिल है। यह प्रक्रिया सही है और जल्दी है। इस विधि हीम जैवसंश्लेषण के सापेक्ष स्तरों के बजाय कुल हीम सामग्री के उपाय। इस techn के उपयोग के प्रदर्शन करने के लिएहीम जैवसंश्लेषण के स्तर Ique कई स्तनधारी सेल लाइनों में मापा गया।
Introduction
हीम, लौह लोहा और protoporphyrin नौवीं की एक जटिल परिवहन और लगभग सभी जीवित जीवों 1-3 में ऑक्सीजन का उपयोग करने के लिए एक केंद्रीय अणु है। हीम की अनोखी संरचना यह द्विपरमाणुक गैसों और इलेक्ट्रॉनों का एक वाहक के रूप में कार्य करने के लिए, साथ ही विभिन्न अन्य कार्यों के 1-5 प्रदर्शन करने के लिए सक्षम बनाता है। उदाहरण के लिए, हीम ऑक्सीजन 6,7 के हस्तांतरण और भंडारण के लिए हीमोग्लोबिन और मायोग्लोबिन में ऑक्सीजन को बांधता है। यह भी श्वसन के दौरान cytochromes में एक इलेक्ट्रॉन वाहक के रूप में काम करता है और साइटोक्रोम P450 एंजाइमों 8,9 द्वारा उत्प्रेरित redox प्रतिक्रियाओं के लिए एक इलेक्ट्रॉन दाता के रूप में कार्य करता है। हीम का सबसे महत्वपूर्ण सुविधाओं में से एक यह इस तरह के जीन प्रतिलेखन, प्रोटीन संश्लेषण और माइक्रो आरएनए जीवजनन 4 के रूप में सेलुलर और आणविक प्रक्रियाओं में नियामक भूमिका निभा सकते हैं, कि है। उदाहरण के लिए, यह स्तनधारी ट्रांसक्रिप्शनल repressor Bach1 की गतिविधि और स्तनधारी परमाणु आरईसी को नियंत्रित करने से कई जीनों के प्रतिलेखन को प्रभावित करता हैeptor रेव erbα 10-15। हीम हीम या ऑक्सीजन 16 के जवाब में, श्वसन और oxidative नुकसान को नियंत्रित करने में शामिल जीनों की सक्रियता में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है जो हीम उत्प्रेरक प्रोटीन (पड़ना) 1 की सक्रियता को नियंत्रित करता है। हीम भी 3,17-20 संकेत तंत्रिका वृद्धि कारक (NGF) के माध्यम से neuronal कोशिकाओं में जीन प्रतिलेखन को नियंत्रित करता है। यह भी हीम विनियमित eIF2α काइनेज (HRI) 21-24 की गतिविधि modulating द्वारा स्तनधारी एर्य्थ्रोइद कोशिकाओं में प्रोटीन संश्लेषण को नियंत्रित करता है। इसके अलावा, हीम उचित सेल कामकाज और सेल के विकास 4,20,25 के लिए आवश्यक हैं जो इस तरह के टाइरोसीन काइनेज Jak2 और एसआरसी के रूप में महत्वपूर्ण संकेत प्रोटीन की गतिविधि को प्रभावित करता है। यह HeLa में कोशिकाओं हीम निषेध वार्धक्य और apoptosis 26 के साथ जुड़े मार्करों के सेल चक्र गिरफ्तारी और सक्रियण का कारण बनता है कि पाया गया था। हीम की कमी या हीम के स्तर में वृद्धि दोनों मानव 27 में गंभीर स्वास्थ्य प्रभाव के साथ जुड़े रहे हैं। हाल ही में आणविक एकएन डी महामारी विज्ञान के अध्ययन के लिए एक उच्च हीम सेवन का सकारात्मक सहयोग और इस तरह के टाइप -2 मधुमेह, हृदय रोग और फेफड़ों के कैंसर, कोलोरेक्टल कैंसर और अग्नाशय के कैंसर 27,28 सहित कई तरह के कैंसर जैसे रोगों का खतरा बढ़ के दिखाया है। सामान्य और कैंसर फेफड़ों की कोशिकाओं लेखक 'प्रयोगशाला की एक मिलान जोड़ी का उपयोग कैंसर की कोशिकाओं को ऑक्सीजन की खपत, हीम संश्लेषण और हीम तेज और ऑक्सीजन के उपयोग में 28 में शामिल प्रोटीन के स्तर में वृद्धि हुई है कि मिल गया है। दिलचस्प है, हीम संश्लेषण के निषेध ऑक्सीजन की खपत, प्रसार, कैंसर की कोशिकाओं को 28 के प्रवास और कॉलोनी के गठन की कमी हुई। इस प्रकार, अंतर्जात हीम के स्तर में उतार-चढ़ाव आणविक और सेलुलर प्रक्रियाओं 3,4,28,29 के नियमन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है।
स्तनधारियों में, हीम के जैवसंश्लेषण माइटोकांड्रिया और साइटोसॉल 4 (चित्रा 1) में स्थित एंजाइमों शामिल आठ चरणों में होता है। हीम बायोसिनथीसिस पक्षक सिन्थेज़ (अफसोस) 4,31 द्वारा उत्प्रेरित 5-aminolevulinic एसिड (5-पक्षक) के लिए फार्म ग्लाइसिन और succinyl-कोए का संक्षेपण, साथ माइटोकॉन्ड्रिया के मैट्रिक्स में शुरू होता है। इस nonerythroid कोशिकाओं में हीम जैवसंश्लेषण में कदम सीमित दर है। 5-Ala तो अगले चार चरणों फिर इसे वापस protoporphyrin नौवीं (PPIX) में बदल जाता है, जहां माइटोकॉन्ड्रिया, करने के लिए आयात किया जाता है, जो coproporphyrinogen तृतीय (CPgenIII), फार्म के लिए होते हैं, जहां साइटोसॉल के लिए बाहर निर्यात किया जाता है। अंत में, लोहे के एक अणु हीम, ferrochelatase (FECH) 2,4 द्वारा उत्प्रेरित एक प्रतिक्रिया का उत्पादन करने के लिए protoporphyrin नौवीं (PPIX) को शामिल किया है।
हीम जैवसंश्लेषण के स्तर पर मुख्य रूप से कसकर इंट्रासेल्युलर लोहा और हीम 4 द्वारा नियंत्रित किया जाता है, जो काश एंजाइम के स्तर पर निर्भर करता है। हीम के जैवसंश्लेषण आनुवंशिक दोष, कुछ खनिज और विटामिन (जैसे, राइबोफ्लेविन, जस्ता), विषाक्त पदार्थों (जैसे, एल्यूमिनियम, सीसा के लिए जोखिम की उपलब्धता से प्रभावित किया जा सकता है), कुछ स्टेरॉयड (के अनॉक्सिता, बुखार, और स्तरों जैसे, एस्ट्रोजन) 32-35। हीम संश्लेषण के स्तर पर विभिन्न रोगग्रस्त परिस्थितियों में बदल दिया है। कमी हीम जैवसंश्लेषण एनीमिया के साथ-साथ मस्तिष्क संबंधी बीमारियों 3,36 पैदा कर सकता है। वैकल्पिक रूप से वृद्धि हुई है, हीम जैवसंश्लेषण कुछ तरह के कैंसर 28,37 की प्रगति में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। हीम स्तनधारी वसा, एर्य्थ्रोइद और neuronal कोशिकाओं 4,38-41 के विकास, भेदभाव और अस्तित्व के लिए महत्वपूर्ण होने के लिए दिखाया गया है। उदाहरण के लिए, हीम कमी ग्लूटामेट NMDA (एन -methyl-डी-aspartate) रिसेप्टर 17 के निषेध के माध्यम से प्राथमिक माउस cortical न्यूरॉन्स में neurite नुकसान होता है। इसके अतिरिक्त, हीम संश्लेषण के निषेध मानव उपकला गर्भाशय ग्रीवा कार्सिनोमा HELA कोशिकाओं 26,41 में प्रोग्राम कोशिका मृत्यु का कारण बनता है। इसलिए, विभिन्न परिस्थितियों में विभिन्न कोशिकाओं में हीम जैवसंश्लेषण स्तर को मापने के एटियलजि और progressi के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण हैकई बीमारियों में से एक पर।
यहाँ हम [4- 14 सी] 5-aminolevulic एसिड का उपयोग करके इंट्रासेल्युलर हीम संश्लेषण के स्तर को मापने के लिए एक तेजी से और संवेदनशील विधि का वर्णन। यह 55 फ़े या 59 फ़े का उपयोग अन्य तरीकों के लिए एक वैकल्पिक तरीका है। इसके विकिरण बहुत कमजोर है क्योंकि हम 14 सी का उपयोग पसंद करते हैं। इसके विपरीत, मजबूत सुरक्षा फे आइसोटोप के साथ काम करने के लिए आवश्यक है। इसके अलावा, इस विधि को मापने के लिए और एक त्वरित ढंग से समानांतर में विभिन्न कोशिकाओं में हीम संश्लेषण की तुलना करने का इरादा है। पूर्ण हीम के स्तर को मापने के लिए आदेश में, एक एचपीएलसी 42,43 के उपयोग से जुड़े पहले से स्थापित विधि का उपयोग कर सकते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
हीम श्वसन 26 के माध्यम से सेलुलर ऊर्जा के उत्पादन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। बदल हीम चयापचय कैंसर 28,41 सहित विभिन्न रोगों के साथ जुड़े होने के लिए जाना जाता है। हीम संश्लेषण के निषेध हेला…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
HCC4017 और HBEC30KT सेल लाइनों कृपया डॉ जॉन मिन्ना प्रयोगशाला द्वारा प्रदान किया गया। इस काम के डॉ ली जांग को सेसिल एच और आईडीए ग्रीन धन के द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Acetone | Sigma | 650501 | |
| Diethy ether | Sigma | 296082 | |
| HCl (Hydrochloric acid) | Fisher | A481-212 | |
| Liquid Scintillation cocktail | MP Biomedicals | 882470 | |
| Trypan blue | Gibco | 15250 | |
| Radiolabeled 4-14C aminolevulinic acid | Perkin-Elmer life sciences | Store @ -80 °C | |
| CelLytic M | Sigma | C2978 | Mammalian cell lysis reagent |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23227 | |
| Specific reagent | |||
| Component | Dispense | ||
| Heme extraction buffer- Acetone: HCl:Water (25:1.3:5) | Acetone | 25ml | |
| Concentrated HCl | 1.3ml | ||
| Water | 5ml |
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