Medición de niveles hemo síntesis en células de mamífero
Summary
Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.
Abstract
Heme sirve como el grupo prostético para una amplia variedad de proteínas conocidas como hemoproteínas, tales como hemoglobina, mioglobina y citocromos. Está implicada en diversos procesos moleculares y celulares, tales como la transcripción de genes, la traducción, la diferenciación celular y la proliferación celular. Los niveles de biosíntesis de hemo varía en los diferentes tejidos y tipos de células y se alteran en condiciones de enfermedad como la anemia, neuropatía y el cáncer. Esta técnica utiliza [4- 14 C] de ácido 5-aminolevulínico ([14 C] 5-ALA), uno de los primeros precursores en la ruta de biosíntesis de hemo para medir los niveles de síntesis de hemo en células de mamífero. Este ensayo implica la incubación de las células con [14 C] 5-ALA seguido de la extracción de hemo y la medición de la radiactividad incorporada en hemo. Este procedimiento es precisa y rápida. Este método mide los niveles relativos de la biosíntesis del grupo hemo, más que el contenido total de hemo. Para demostrar el uso de esta technIQUE los niveles de biosíntesis de hemo se midieron en varias líneas celulares de mamíferos.
Introduction
Hemo, un complejo de hierro ferroso y protoporfirina IX es una molécula central para el transporte y la utilización de oxígeno en los organismos que viven prácticamente todos 1-3. La estructura única de hemo le permite funcionar como un portador de gases diatómicos y electrones, así como para realizar diversas otras funciones 1-5. Por ejemplo, hemo se une al oxígeno en la hemoglobina y la mioglobina para la transferencia y el almacenamiento de 6,7 oxígeno. También funciona como un transportador de electrones en los citocromos durante la respiración y actúa como un donador de electrones para las reacciones redox catalizadas por enzimas del citocromo P450 8,9. Una de las características más significativas de hemo es que, puede desempeñar un papel regulador en los procesos celulares y moleculares, tales como la transcripción de genes, síntesis de proteínas y micro-ARN biogénesis 4. Por ejemplo, afecta a la transcripción de muchos genes mediante el control de la actividad de represor transcripcional de mamífero Bach1 y la rec nuclear de mamíferoeptor Rev-erbα 10-15. Heme regula la activación de la proteína activadora de hemo (Hap) 1 que desempeña un papel importante en la activación de genes implicados en la respiración y controlar el daño oxidativo, en respuesta a heme o de oxígeno 16. Heme también regula la transcripción de genes en las células neuronales a través de factor de crecimiento nervioso (NGF) de señalización 3,17-20. También regula la síntesis de proteínas en las células eritroides de mamífero mediante la modulación de la actividad de quinasa eIF2α hemo-regulados (HRI) 21-24. Además, hemo afecta a la actividad de las proteínas de señalización clave como la tirosina quinasa Src y Jak2, que son esenciales para el funcionamiento adecuado de las células y 4,20,25 crecimiento celular. Se encontró que en células HeLa inhibición heme provoca la detención del ciclo celular y la activación de marcadores asociados con la senescencia y apoptosis 26. Tanto la deficiencia de hemo o aumento de los niveles de hemo se asocian con efectos graves para la salud en los seres humanos 27. Recientes un molecularnd estudios epidemiológicos han mostrado una asociación positiva de alto consumo hemo y aumento del riesgo de enfermedades, tales como diabetes tipo 2, enfermedad coronaria y varios tipos de cáncer, incluyendo cáncer de pulmón, cáncer colorrectal y cáncer de páncreas 27,28. El uso de un par emparejado de laboratorio de células pulmonares normales y cancerosas autores han encontrado que las células cancerosas se han incrementado los niveles de consumo de oxígeno, la síntesis del grupo hemo y proteínas implicadas en la captación de hemo y oxígeno utilización 28. Curiosamente, la inhibición de la síntesis de hemo disminuyó el consumo de oxígeno, la proliferación, la migración y la formación de colonias de células de cáncer 28. Por lo tanto, la fluctuación en los niveles de hemo endógeno juega un papel importante en la regulación de procesos moleculares y celulares 3,4,28,29.
En los mamíferos, la biosíntesis de hemo se produce en ocho etapas, que implican enzimas localizadas en la mitocondria y el citosol 4 (Figura 1). Bios hemotesis comienza en la matriz de la mitocondria con la condensación de glicina y succinil-CoA reductasa para formar ácido 5-aminolevulínico (5-ALA), catalizada por ALA sintasa (ALAS) 4,31. Este es el paso limitante en la biosíntesis de hemo en células no eritroides. 5-ALA entonces se exporta hacia el citosol, donde se producen los siguientes cuatro pasos para formar coproporfirinógeno III (CPgenIII), que luego se importa de nuevo a las mitocondrias, donde se convierte en la protoporfirina IX (PPIX). Finalmente, una molécula de hierro se incorpora a la protoporfirina IX (PPIX) para producir hemo, una reacción catalizada por ferroquelatasa (FECH) 2,4.
El nivel de la biosíntesis de hemo depende principalmente del nivel de enzima ALAS que está estrechamente controlada por el hierro hemo intracelular y 4. La biosíntesis de hemo puede verse afectada por defectos genéticos, la disponibilidad de ciertos minerales y vitaminas (por ejemplo, riboflavina, zinc), la exposición a toxinas (por ejemplo, aluminio, plomo), Anoxia, fiebre, y los niveles de ciertos esteroides (por ejemplo, estrógeno) 32-35. El nivel de la síntesis de hemo se altera en diversas condiciones de enfermedad. Disminución de la biosíntesis del grupo hemo puede causar anemia, así como enfermedades neurológicas 3,36. Alternativamente, el aumento de la biosíntesis de hemo juega un papel importante en la progresión de ciertos cánceres 28,37. Heme ha demostrado ser crítico para el crecimiento, la diferenciación y la supervivencia de los mamíferos adiposo, eritroides y células neuronales 4,38-41. Por ejemplo, la deficiencia de hemo conduce a un daño de neuritas en neuronas corticales de ratón primaria a través de la inhibición de glutamato NMDA (N-metil-D-aspartato) receptor 17. Además, la inhibición de la síntesis de hemo causa la muerte celular programada en el carcinoma de cuello uterino humano epitelial células HeLa 26,41. Por lo tanto, la medición de los niveles de biosíntesis de hemo en diversas células bajo diferentes condiciones es importante para el estudio de la etiología y progressien de muchas enfermedades.
Aquí se describe un método rápido y sensible para medir el nivel de la síntesis de hemo intracelular mediante el uso de [4- 14 C] de ácido 5-aminolevulic. Este es un método alternativo a otros métodos que utilizan 55 o 59 Fe Fe. Preferimos utilizando 14 C porque su radiación es muy débil. Por el contrario, se requiere una fuerte protección para trabajar con isótopos Fe. Además, este método está destinado a medir y comparar la síntesis de hemo en diferentes células en paralelo de una manera rápida. Con el fin de medir los niveles de hemo absolutos, se puede utilizar el método previamente establecido que implica el uso de HPLC 42,43.
Protocol
Representative Results
Discussion
Heme juega un papel clave en la generación de energía celular a través de la respiración 26. El metabolismo del hemo Altered se sabe que está asociado con varias enfermedades, incluyendo el cáncer 28,41. La inhibición de la síntesis del grupo hemo se sabe que causa la detención del ciclo celular y la apoptosis en células HeLa 26,41. Se ha demostrado que el nivel de la síntesis de hemo alta se asocia con la progresión de las células de cáncer de pulmón 28. Por lo…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Las líneas de células HCC4017 y HBEC30KT fueron amablemente proporcionados por el laboratorio del Dr. John Minna. Este trabajo fue apoyado por los fondos de Cecil H. e Ida verdes al Dr. Li Zhang.
Materials
| Acetone | Sigma | 650501 | |
| Diethy ether | Sigma | 296082 | |
| HCl (Hydrochloric acid) | Fisher | A481-212 | |
| Liquid Scintillation cocktail | MP Biomedicals | 882470 | |
| Trypan blue | Gibco | 15250 | |
| Radiolabeled 4-14C aminolevulinic acid | Perkin-Elmer life sciences | Store @ -80 °C | |
| CelLytic M | Sigma | C2978 | Mammalian cell lysis reagent |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23227 | |
| Specific reagent | |||
| Component | Dispense | ||
| Heme extraction buffer- Acetone: HCl:Water (25:1.3:5) | Acetone | 25ml | |
| Concentrated HCl | 1.3ml | ||
| Water | 5ml |
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