Elastin-lignende polypeptider er stimulus-responsive biopolymerer med applikasjoner som spenner fra rekombinant protein rensing til levering av legemidler. Denne protokollen beskriver rensingen og karakteriseringen av elastin-lignende polypeptider og deres peptid-eller protein-fusjoner fra Escherichia coli ved hjelp av sin nedre kritiske løsningstemperaturen faseovergang oppførsel som et enkelt alternativ til kromatografi.
Elastin-lignende polypeptider er repeterende biopolymerer som viser en lavere kritisk løsning temperatur faseovergangen atferd, eksisterende som løselig unimers under et karakteristisk overgang temperatur og aggregere i mikron-skala coacervates over deres overgang temperatur. Utformingen av elastin-lignende polypeptider på genetisk nivå tillater nøyaktig kontroll av deres sekvens og lengde, som bestemmer deres termiske egenskaper. Elastin-lignende polypeptider brukes i en rekke applikasjoner, inkludert biosensing, tissue engineering, og levering av legemidler, der overgangen temperatur og biopolymer arkitektur av ELP kan være innstilt for den spesifikke anvendelsen av interesse. Videre tillater den nedre kritiske temperatur løsningen faseovergangs oppførselen til elastin-lignende polypeptider deres rensing ved deres termiske respons, slik at de selektivt reversibel koaguleringsteknikk og resolubilization tillater fjerning av både løselige og uløselige forurensningers følgende uttrykk i Escherichia coli. Denne tilnærmingen kan brukes for rensing av elastin-lignende polypeptider alene eller som et renseverktøy for peptid-eller protein-fusjoner hvor rekombinante peptider eller proteiner genetisk vedføyde til elastin-lignende polypeptid-lapper kan bli renset uten kromatografi. Denne protokollen beskriver rensing av elastin-lignende polypeptider og deres peptid-eller protein-fusjoner og diskuterer basiskarakteriseringsteknikker for å bedømme den termiske oppførselen av rene elastin-lignende polypeptid-produkter.
Elastin-lignende polypeptider (elps) er biopolymerer sammensatt av gjentakende pentapeptide VPGXG der X, gjesten rester, er enhver aminosyre unntatt prolin. Elps utstillings nedre kritiske temperatur-løsning (LCST) faseovergangs oppførsel, slik at en homogen ELP løsningen vil skille seg i to faser ved oppvarming til sin LCST, som vanligvis blir kalt inverse overgangstemperatur (T t) i ELP litteratur 1.. De to faser består av en meget fortynnet ELP Globule fase og en ELP rik sediment fase. ELP rik sedimentet er dannet på en kort tidsskala på aggregering av ELP kjedene i mikron-størrelse partikler som senere vokser sammen. Dette skjer over et område på noen få grader Celsius, og er typisk reversible, som en homogen oppløsning gjenvinnes ved retur til en temperatur under T t.
Elps er vanligvis syntetisert i Escherichia coli (E. coli) from en kunstig gen som ligeres til et ekspresjonsplasmid. Dette plasmid ble så transformert inn i en E. coli cellelinje som er optimal for proteinekspresjon. Vi har utelukkende brukt til T7-lac pET vektoren system for ekspresjon av et stort utvalg av elps i E. coli, selv om andre ekspresjonssystemer i gjær 2-4, sopp 5, og plantene 6-8 har også blitt benyttet av andre forskere. En rekke tilnærminger eksisterer for å genetisk konstruere repetitive ELP gener, inkludert rekursiv retnings ligation (RDL) 9, rekursiv retnings ligation av plasmid rekonstruksjon (pre-RDL) 10, og overlapper forlengelse rullende sirkel forsterkning (OERCA) 11. Evnen til å konstruere elps på genetisk nivå gir mulighet til å bruke rekombinante DNA-teknikker for å lage elps med forskjellige arkitekturer (f.eks, mono, diblocks, triblocks, etc.), som kan bli ytterligere føyes med funksjonellepeptider og proteiner. Kontroll på genetisk nivå sikrer også at hver ELP uttrykkes med den nøyaktige lengde og sammensetning diktert av dens genetiske plasmid-mal, noe som gir perfekt monodisperse biopolymer produkter.
De termiske egenskapene til hver ELP avhenge av parametere iboende til biopolymer slik som molekylvekt (MW) og sekvens, så vel som ytre faktorer, inkludert konsentrasjonen i oppløsningen, og nærværet av andre cosolutes, for eksempel salter. Lengden av ELP 12 og dens gjest rester sammensetning 1, 13, 14 er to ortogonale parametre i ELP utforming som kan brukes til å kontrollere T-T, hvor gjeste hydrofobe rester og lengre kjedelengder gir lavere T t s, mens hydrofile gjesteRester og kortere kjedelengde resultere i høyere T t s. ELP konsentrasjonen er omvendt relatert til T-t, hvor oppløsninger av greater ELP konsentrasjon har lavere T t s 12. Typen og konsentrasjonen av salter også påvirke ELP T t, hvor effekten av salter følger Hofmeister-serien 15.. Kosmotropic anioner (Cl – og høyere på Hofmeister serien) senke ELP T t og økende saltkonsentrasjon forsterker denne effekten. Disse indre og ytre parametere kan være innstilt til å få termisk oppførsel innenfor et mål temperaturområde som er nødvendig for en bestemt anvendelse av en ELP.
Stimulus-responsive atferd elps er nyttig for en rekke ulike bruksområder, inkludert biosensing 16, 17, tissue engineering 18, og levering av legemidler 19, 20. I tillegg, når elps er kondensert til peptider eller proteiner ved genetisk nivå, kan ELP tjene som en enkel rensing kode for å tilveiebringe en billig fremgangsmåte for satsvis rensing av rekombinant peptidevann eller proteiner som krever ingen kromatografi 21. Modifikasjon av renseprosessen sikrer at aktiviteten av peptidet eller proteinet fusjonert til ELP opprettholdes. Peptid eller protein ELP fusjoner kan bli renset for anvendelser der ELP tag er nyttig 22, 23 eller alternativt når fritt peptid eller protein er nødvendig, kan en protease anerkjennelse stedet settes inn mellom peptid eller protein og ELP. Fjerning av ELP koden kan da oppnås ved fordøyelsen med gratis protease eller en protease ELP fusjon, hvor sistnevnte gir den ekstra enkel behandling som en siste runde med ELP rensing kan skille ELP tag og protease ELP fusjon fra målet peptid eller protein i et enkelt trinn 24, 25. Den følgende protokoll beskriver rensing fremgangsmåte for elps og peptid-eller protein-fusjoner ELP ved hjelp av sine termiske egenskaper, og drøfter grunnleggende teknikker for å karakterisereden termiske responsen ELP produkter.
Elps tilby en billig og kromatografi-free hjelp av rensing ved utnyttelse av deres stimulus-responsive faseoppførsel. Denne tilnærmingen utnyttet LCST oppførselen til elps og peptid eller protein ELP fusjoner for å eliminere både løselig og uløselig forurensninger etter uttrykk for genetisk kodet elps i E. coli. Denne lette rensing kan anvendes til å produsere elps for en rekke applikasjoner, eller kan utnyttes for rensing av rekombinante peptider eller proteiner hvori ELP kan fungere som en rense kode som kan fjernes med etter-rensing prosessering.
ELP rensing innebærer innledende trinn for å lysere E. coli og fjerne genomisk og uløselige cellerester fra det rå lysatet kultur (figur 1), etterfulgt av fjerning av resterende oppløselige og uoppløselige forurensninger ved ITC (figur 2). Sentrifugering etter å ha utløst den ELP overgangen ved å tilsettening av varme eller salt skiller ELP fra oppløselige forurensninger i den overliggende, i et trinn betegnet som en varm spinn. Etter resolubilizing ELP, oppløsningen sentrifugeres igjen ved en temperatur under T t for å fjerne uoppløselige forurensninger pellet, i et trinn betegnet som en kaldsentrifugering. Alternerende varme og kalde spinn forbedrer renheten av ELP-løsning med hver syklus, til en liten kostnad å gi etter. Rensing utbytter varierer avhengig av ELP T t, lengde og smeltet peptider eller proteiner. Vanligvis gir denne protokollen 100 mg av renset ELP per liter E. coli kultur, men rentene kan nå opp til 500 mg / L. Den endelige renhet av ELP produktet er bekreftet ved hjelp av SDS-PAGE (figur 3). Den MW av renset ELP bør matche tett med den teoretiske MW kodet av ELP genet. Men noen elps vandrer i SDS-PAGE med en tilsynelatende MW opptil 20% høyere enn de forventede MW 9, 27.. Mer presis analyse av ELPMW kan oppnås ved MALDI-TOF-MS, som også kan gi ytterligere informasjon om renheten av ELP produktet sammen med ortogonale analytiske teknikker som høy ytelse væskekromatografi (HPLC).
Etter rensing blir ELP T t målt ved temperatur-programmert turbidimetri. Denne teknikken overvåker OD av en ELP-løsning mens temperaturen økes. Den T t er konsentrasjonsavhengig, så er det tilrådelig å karakterisere en konsentrasjonsserie som er relevant for den tilsiktede anvendelse av ELP. For ELP homopolymerer turbiditeten profilen oppviser en enkelt skarp økning som svarer til den ELP overgang fra Unimer til mikron-skala aggregater (figur 4A). Den T t er definert som den temperatur som svarer til den infleksjonspunktet i turbiditeten profil, nøyaktig bestemt som maksimum av den første deriverte av OD med hensyn til temperatur. Reversibilitet avELP faseovergangen er bekreftet ved en reduksjon i OD til utgangspunktet som er senket temperatur under T t (Figur 4B). Turbiditeten profil med økende og avtagende temperatur ramper vil variere i omfang og kinetikk på grunn av bosetting av ELP coacervates og variabel hysterese på ELP resolubilization. Peptid-eller protein ELP fusions likeledes oppviser LCST oppførsel på denne måten, der peptidet eller proteinet fusjonert til ELP påvirker T t. For protein ELP fusjoner overgangen er reversibel under smeltetemperaturen for proteinet. Mens temperatur-programmert turbidimetri er en utmerket metode for den første varme karakterisering av ELP-produkter, alternative teknikker, slik som differensial scanning kalorimetri (DSC), kan også brukes til å måle ELP T t.
Elps med mer komplekse arkitekturer utstillings mer kompliserte termiske atferd som kan også være preget av temperatur-programmed turbidimetri. ELP diblock kopolymerer, for eksempel vise en karakteristisk turbiditet profil tilsvarende deres temperatur-utløst selvbygging til sfæriske miceller på deres kritiske micellization temperatur. For slike ELP diblokk-kopolymerer OD typisk først økes 0,1 til 0,5 enheter over grunnlinjen som angir overgangen fra unimers til miceller, hvoretter en kraftig økning i OD (opp til 2,0 enheter over utgangsverdien) ved en høyere temperatur indikerer dannelsen av mikrometer-skala tilslag (Figur 5A). Ytterligere informasjon om temperatur utløst selv-montert ELP strukturer oppnås med DLS, en teknikk som måler R H av ELP forsamlinger i løsningen. Endringer i R H enig tett med endringer i OD målt med turbidimetri (Figur 5B). ELP unimers typisk et R H <10 nm mens nanopartikkel forsamlinger utviser en R H ~ 20-100 nm og aggregater vise en R H </sub >> 500 nm. Ytterligere informasjon om selv-montert ELP nanopartikler, slik som aggregering nummer og morfologi, kan fås ved statisk lysspredning eller kryogen transmisjonselektronmikroskopi 17, 23, 29..
På grunn av den tunability av ELP termiske egenskaper, er en rekke av T-t s oppnådd ved forskjellige ELP utførelser. Det er viktig å huske på at den iboende T t vil påvirke optimalisering av renseprotokoll for hver ELP, hvor ekstremt lav eller høy T t s vil kreve mest modifikasjon til denne standardprotokollen. Elps med ekstremt høye overgangstemperaturer kan være uegnet for rensing med denne tilnærming. Hvis utformingen av romanen elps og peptid eller protein ELP fusjoner kan kompromittere den termiske responsen i ELP, kan en enkel histidin tag inkluderes for alternativ rensing ved immobilisert metall affinitet kromatografi. I tilleggegenskapene til ELP sekvensen kan kreve endring av denne protokollen hvis gjesten rester belastes. Manipulering av buffer pH kan anvendes som en metode for å endre den totale ladning av den ELP i et forsøk på å eliminere elektrostatiske interaksjoner med forurensninger 17. Videre er denne protokoll egnet for det spesielle tilfelle av ELP fusjoner med peptider og proteiner ved passende tiltak iverksettes for å sikre at renseprosessen ikke forstyrre aktiviteten av den kondenserte del. Noter hele protokollen på slike modifikasjoner tjener til direkte rensing av elps som kan presentere disse utfordringene med hensyn til T t, kostnad, eller fusjons bekymringer.
Denne rensing av elps ved hjelp av deres LCST oppførsel presenterer en enkel og kromatografi fritt tilnærming for å rense de fleste elps og peptid eller protein ELP fusjoner uttrykt i E. coli. Protokollen oppsummert her tillater rensing of elps i en enkelt dag ved hjelp av utstyr som er felles for de fleste biologiske laboratorier. Den enkle rensing av elps og deres fusjoner vil, vi håper, oppfordrer en stadig voksende mangfold av ELP design for nye anvendelser innen materialvitenskap, bioteknologi og medisin.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av NSFs Research Triangle MRSEC (DMR-1121107).
pET-24a(+) pET-25b(+) |
Novagen | 69749-3 69753-3 |
T7-lac expression vectors with resistance to kanamycin (pET-24) or ampicillin (pET-25). |
Ultra BL21 (DE3) competent cells | Edge BioSystems | 45363 | Competent E. coli for recombinant protein expression. |
Terrific Broth (TB) Dry Powder Growth Media | MO BIO Laboratories | 12105 | Media is reconstituted in DI H2O and autoclaved before use. |
Isopropyl-beta-D-thiogalactoside (IPTG) | Gold Biotechnology | I2481C | IPTG is reconstituted in DI H2O, sterile filtered, and added to cultures to induce enhanced expression. |
Phosphate buffered saline (PBS) tablet | Calbiochem | 524650 | These PBS tablets, when dissolved in 1 L of DI H2O, yield a 10 mM phosphate buffer with 140 mM NaCl, and 3 mM KCl with a pH of 7.4 at 25 °C. |
Polyethyleneimine (PEI) Solution (~50% w/v) | MP Biomedicals | 195444 | PEI is prepared as a 10% (w/v) solution in deionized H2O. |
Nalgene Oak Ridge high-speed centrifuge tubes, 50 mL | Thermo Scientific | 3138-0050 | These round-bottom tubes withstand high-speed centrifugation of 30-50 ml. |
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP-HCl) | Thermo Scientific | 20491 | A stock solution of TCEP-HCl is prepared at 100 mM in DI H2O and adjusted to pH 7.0. For ELPs with a high cysteine content the stock solution of this reducing agent is added to the ELP pellet to reach 10 mM in H2O. |
Ready Gel Tris-HCL gel, 4-20% linear gradient polyacrylamide gel, 10 well, 30 μl | Bio-Rad Laboratories | 161-1105 | These linear gradient gels offer good visualization of ELPs with a range of MWs. |
Cupric chloride dihydrate (CuCl2-2H2O) | Fisher Scientific | C454-500 | A filtered 0.5 M solution is prepared for negative staining of Tris-HCL polyacrylamide gels. |
Anotop 10 syringe filter: 0.02 μm 0.1 μm 0.2 μm |
Whatman | 6809-1002 6809-1012 6809-1022 |
These 10 mm diameter syringe filters allow preparation of small volumes for DLS measurements. |
Millex-HV filter: 0.45 μm |
EMD Millipore | SLHVX13NK | These 13 mm diameter syringe filters allow preparation of small volumes of solutions with large nanoparticle assemblies for DLS measurements. |