The analysis of skeletal muscle tissues to determine structural, functional, and biochemical properties is greatly facilitated by appropriate preparation. This protocol describes appropriate methods to prepare skeletal muscle tissue for a broad range of phenotyping studies.
Skjelettmuskulatur er en unik vev på grunn av sin struktur og funksjon, som krever spesifikke protokoller for vev samling for å oppnå optimale resultater fra funksjonelle, cellulære, molekylære, og patologiske evalueringer. På grunn av subtilitet av noen patologiske forandringer sett i medfødte muskelsykdommer og potensialet for fiksering å forstyrre med anerkjennelsen av disse funksjonene, er patologisk evaluering av frossen muskel foretrekke fremfor faste muskler ved vurdering av skjelettmuskulatur for medfødt muskelsykdom. I tillegg potensial til å produsere alvorlige frysing artefakter i muskel krever spesielle forholdsregler når man fryser skjelettmuskulatur for histologisk undersøkelse som ikke er allment brukt når man fryser andre vev. Dette manuskriptet beskriver en protokoll for hurtig frysing av skjelettmuskel ved hjelp av isopentan (2-metylbutan) avkjølt med flytende nitrogen for å opprettholde optimal skjelettmuskel morfologi. Denne fremgangsmåten er også effektiv for freezing vev beregnet for genetiske eller protein expression studier. Videre har vi integrert vår frysing protokollen inn i en bredere prosedyre som også beskriver foretrukne metoder for på kort sikt triage av vev for (1) enkelt fiber funksjonelle studier og (2) myoblast cellekultur, med fokus på minimal innsats er nødvendig for å samle vev og frakte den til spesialiserte forsknings-eller referanselaboratorier for å fullføre disse studiene. Samlet gir dette manuskriptet en oversikt over hvor frisk vev kan bli effektivt distribuert til en rekke fenotypiske studier og dermed gir standard operasjonsprosedyrer (SOP) for patologiske studier knyttet til medfødt muskelsykdom.
Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which can present a number of challenges when evaluating its pathology. While it is sufficient, and often even optimal, to evaluate most tissues following formalin fixation and paraffin embedding, this process leads to the production of cell shrinkage artifacts that impair the evaluation of critical phenotypes in congenital muscle disease (including myofiber size and shape). Additionally, frozen muscle is required when performing many histochemical stains (including the reduced nicotinamide adenine dinucleotide (NADH), cytochrome oxidase (COX), succinate dehyrogenase (SDH), adenosine triphosphatase (ATPase), and Oil Red O stains) that are essential for the detection of specific pathological abnormalities required to diagnose a variety of congenital myopathies, mitochondrial myopathies, and storage diseases. Many antibodies and molecular tools used to characterize muscle morphology and function have consequently been developed and optimized only for frozen tissue, which further limits the usefulness of fixed tissue preparations in studies of skeletal muscle biology. As a result, it has become standard practice to freeze skeletal muscle specimens for most clinical and research indications in the field of congenital muscle disease, despite the technical challenges that appropriate freezing might pose.
The freezing of skeletal muscle can be technically challenging due to the high likelihood of ice crystal formation within myofibers when an inappropriate freezing protocol is followed1. In most cases, freezing artifacts are encountered when the water content of the tissue is too high or when the freezing process is too slow. The water content of tissue can be accidentally increased by immersion in fluid, such as transport of the muscle in saline; or freezing can be compromised if the tissue has been entirely immersed in OCT. Both of these procedures can lead to catastrophic freezing artifacts in muscle tissue. Additionally, a number of small missteps in the freezing process may cause slow freezing or accidental thawing of samples after appropriate freezing, and these issues can similarly complicate pathological evaluation.
As new models and treatments for skeletal muscle disease are developed, it will become increasingly useful to use standard operating procedures (SOPs) to evaluate skeletal muscle phenotypes and treatment efficacy. This is particularly important for the pathological evaluation of congenital muscle diseases, as the recognition of subtle phenotypes seen in many of these disorders can be impaired by improper tissue preparation. This report represents an effort by a Congenital Muscle Disease Consortium to establish a skeletal muscle freezing SOP for the study of congenital muscle disease models.
The protocol presented here describes a strategy used in our clinical and research labs to optimize assessment of frozen muscle pathology, while also being suitable for a variety of protein-based and genetic studies. Specific strategies to prepare skeletal muscle specimens for electron microscopy are also presented. Additionally, as single fiber functional testing of frozen tissue is possible2,3, experts in these techniques have provided details on optimal tissue handling protocols. Unfortunately, the isolation of myoblast cell lines cannot be effectively performed on pre-frozen tissue, so a strategy is presented herein for the short-term storage and transport of muscle tissue for myoblast culture establishment at outside laboratories. Overall, the methods described here provide guidelines for the appropriate processing of muscle tissue for a variety of pathological, functional, molecular and cellular studies, regardless of the on-site capabilities of a given laboratory.
Skjelettmuskel er strukturelt og funksjonelt unik vev, og spesialiserte forberedende tiltak er nødvendige for å tillate optimal vurdering av strukturelle og funksjonelle parametre. Mens en rekke vev er ofte frosset for patologiske studier i klinisk og forskningsmessig, frysing protokoller for ikke-muskel vev som regel innebære total nedsenking av vevet i oktober før frysing. Som vist i figur 3, er en slik protokoll uegnet for patologisk vurdering av skjelettmuskulatur, og likevel er like nok til protokollen som er beskrevet her at dette er en vanlig forekommende feil. Målet med denne artikkelen er å gi en enkel protokoll for riktig håndtering av muskler for å unngå problemer som dette. Råd har også blitt utarbeidet på forsvarlig håndtering av muskel for off-site fysiologiske og cellulære studier i et forsøk på å legge til rette for kjøp av data av høy kvalitet ved utenom kjerne laboratorier i tilfeller Where på stedet studier er ikke å foretrekke eller mulig.
Som angitt i denne protokoll, elementer som er helt avgjørende i riktig behandling av muskel for patologiske undersøkelser omfatter å redusere vanninnholdet i vevet, redusere den temperatur ved hvilken muskelen er frosset, og å øke hastigheten ved hvilken frysing er oppnådd. For mye fuktighet i vevet eller overdreven treghet av fryseprosessen (produsert av utilstrekkelig temperatur, eller mangel på direkte kontakt mellom frysemiddel og vev, som er påtruffet med flytende nitrogen) vil føre til frysing artefakter som kan svekke patologisk analyse. Som oktober gir en ekstra kilde til vevsfuktighet, mange laboratorier bruker andre lim som gummitragant som en embedding substrat. Selv i tilfeller der frysing er utført på riktig måte, bør man sørge for å unngå senere uhell tining prøver gjennom kontakt med RT containere eller instrumenter.Således krever en vellykket frysing en grad av planlegging som inneholder en pre-kjøling av alle instrumenter og beholdere som skal benyttes. Ved frysing gjenstander er oppstått, er det en fremgangsmåte som beskrives her for utvinning av vev som er tilstrekkelig for de fleste patologiske evalueringer. Men denne fryse / tine-syklus tilbyr ikke perfekt histologi, og har potensiale til å påvirke andre molekylære eller enzymatiske undersøkelser av vevet (i tillegg til den tid som kreves for å re-fryse vevet), slik at ved bruk av passende startfryse praksis er langt å foretrekke . I de tilfeller hvor frysing gjenstand er oppstått på pre-frosne vev kan imidlertid den teknikk som er beskrevet her, kan være meget nyttig.
Fiksering og behandling av vev for EM kan tilby spesifikke tekniske utfordringer som krever planlegging før vev samling. Den vanligste feilen når samle prøver for EM innebærer bruk av vev fragmenter som er for tykk for glutaraldehyde å trenge gjennom. Som glutaraldehyd kun penetrerer omtrent 0,1 cm inn i muskelvevet fra en gitt overflate, forsiktighet bør utvises for å sikre at en dimensjon av de elektromagnetiske prøvene ikke er tykkere enn 0,2 cm. I tillegg, som EM er et utmerket middel for direkte å evaluere den kontraktile apparat, har noen forskere utviklet strategier for å pre-spenning eller forstrekking muskelen før fiksering for å tillate måling av kontraktile elementer ved en fysiologisk relevant spenning. Det er ingen standard protokoll for forspenning, men to strategiene er kort beskrevet i denne protokollen. Det bør bemerkes at forsøk på å forspenning muskelen kan gi uforutsette resultater med mindre de er gjort på en veldig bestemt måte, og det kan være en fordel å fikse musklene i slakk tilstand for å hindre artifactual endringer i sarkomerlengde gjennom en ikke-standard forspenning prosedyre 8,9. For muskler der slike konkrete målinger er ikke nødvendig (inkludert de fleste biopsies utført for kliniske formål), er arbeidet med å forhånds spenning i muskelen generelt ikke gjort, og den viktigste effekten på muskel morfologi er en uensartet avstand på sarcomeres i muskelen.
Denne artikkelen er den første i en serie for å gi SOPer for utførelsen av tester i medfødt muskelsykdom feltet, og det representerer innsatsen til over 20 eksperter på medfødt muskelsykdom felt som rutinemessig utføre mobilnettet, molekylær, funksjonelle, fysiologiske, og patologisk forskning. En rekke publiserte SOPer vil bli gjort tilgjengelig i løpet av det kommende året, og de nødvendige protokoller og riktig bok formater for hvert ble diskutert på en medfødt muskelsykdom Consortium Workshop avholdt i april 2013 i Washington DC Målet med denne SOP innsats er å gi et veikart for den nødvendige testing og analyse av prøver i medfødt muskelsykdom feltet til en) standardisere praksis og endepunkter som brukes i vårt felt som mUCH som mulig, og 2) gi instruksjon på standard praksis for nye forskere i vårt felt. Vi mener at disse ressursene vil lette oppføring av nye etterforskere i vår under-studert feltet og dermed forbedre omfanget av forskning som kan utføres. I tillegg vil en standardisering av praksis være svært nyttig for å sammenligne data på tvers av studier og å identifisere endepunkter ved planlegging og gjennomføring prekliniske og kliniske studier.
Mens hovedfokus i denne artikkelen er relatert til den aktuelle frysing og utarbeidelse av vev for en rekke studier, vår samarbeidsgruppe diskuterte også de nyttige endepunkter for patologisk analyse av muskelprøver. I dag er det ingen offisiell enighet om tilnærmingen til å ta ved utføring av patologisk analyse, og en rekke forskjellige undersøkelser er utført for å relatere nye oppdagelsene til tidligere publikasjoner for hver respektive sykdom. Derfor tenkte vi at det ville være nyttig åforeslå noen generelle retningslinjer for planlegging av patologiske endepunkter i muskel patologi karakterisering. Før kvantifisere patologi i en undersøkelse, må betydelig tenkte bli satt inn 1) metoden for fiberstørrelse måling, 2) mulighet for fiber-type-spesifikke abnormaliteter eller behandlingsvirkninger, 3) mulighet for uregelmessigheter eller effekter som er begrenset til individuelle muskler, og 4) en strategi for å kvantifisere patologiske funn som er karakteristisk for sykdommen under studien. Fiber størrelse er en nødvendig endepunkt for de fleste studier, og dessverre er det omfattende variasjon i hvordan det er kvantifisert. Mange studier rapporterer disse resultatene ved hjelp av automatiserte kvantifisering metoder som tilbys av proprietære bildebehandlingsprogrammer, men mange av disse programmene ta snarveier (for eksempel anta at fibrene er sirkler eller ellipser) som kan gjengi disse automatiserte målingene unøyaktig. Det er nødvendig å forstå hvordan disse automatiske programmer gjør sine målinger before å ha tillit til målingene, og vi oppfordrer etterforskerne å inkludere disse detaljene i papir metoder. I tillegg er den spesifikke målingen som brukes til å betegne fiberstørrelsen er svært variabel, og enkelte målinger er å foretrekke fremfor andre, 10,11. En vanlig brukt måling av fiberstørrelsen er den fibertverrsnittsareal (CSA), særlig fordi undersøkere som utfører fysiologiske studier standardisere deres resultater for å CSA målinger innhentet ved hjelp av sine instrumenter. Dessverre, mens CSA målinger kan nøyaktig reflektere fiberstørrelse i perfekt tverrgående seksjoner, er de i stor utstrekning er avhengig av fiberretningen (i den utstrekning det langsgående eller skrått-delt fibrene vil ha kunstig høye CSA-måling), og er derfor ikke ideelt mål for fiberstørrelse. Et foretrukket måling av fiberstørrelse som er mindre avhengig av fibertverrsnittsareal er minimum Feret største diameter (MinFeret diameter), som er måling av the mindre diameter i muskelcellen 12. Denne måling er bare svakt avhengig av fiberorientering, og er generelt klinisk gull-standarden for fibermåling, og undersøkere oppfordres til å bevege seg mot bruken av denne teknikk. Disse målingene kan ofte gjøres ved hjelp av den samme programvaren som genererer CSA målinger 13, og er også grei å måle manuelt. Med hensyn til å vurdere patologiske data etter type fiber, bestemt muskel, og i sammenheng med patologiske funn knyttet til den spesifikke sykdommen, disse er mindre kontroversielle spørsmål som bør bare vurderes under planleggingen av en studie. Fibertype kan evalueres ved hjelp av immunhistokjemiske eller ATPase flekker, men det er nyttig å tenke på at spesifikke muskler og dyrearter har spesifikke blandinger av disse fibertyper (og dermed nødvendiggjør ulike forventninger og teststrategier). Muscle bestemt patologisk engasjement eller behandlingseffektenkan forekomme, og total muskelvekt sammenlignet med kontroller kan brukes for å identifisere graden av heterogenitet av sykdommen før de bestemmer på musklene til patologisk evaluere. Endelig, er det velkjent at mange muskel sykdommer er assosiert med spesifikke patologiske abnormiteter (f.eks nemalin stenger i nemalin myopati) 14,15, og så er det også nyttig å vurdere hvorvidt disse abnormiteter er funnet i en fiber-type-eller muskel -spesifikk fordeling for utførelse av analysen 16,17. Total, mens vi ikke foreslå en lite fleksibel sett med standarder for evaluering av muskel, tror vi at disse spørsmålene bør vurderes før utførelsen av patologiske undersøkelser i noen skjelettmuskelsykdommer.
The authors have nothing to disclose.
This publication is funded through Cure CMD, an Association Contre Les Myopathies (AFM) grant (project 16297), and the National Institutes of Health (grant numbers K08 AR059750 and L40 AR057721). We would also like to thank Dr. Julie Tetzlaff for her assistance in revising this manuscript.
For tissue freezing | |||
Liquid nitrogen Dewar with a liquid withdrawal device | Custom Biogenic Systems | Lab-5 Series | Any other liquid nitrogen dewar could substitute. |
Cold-conductive container | Fisher | 02-583A | |
Wide insulated container capable of holding liquid nitrogen | Nalgene | 4150-2000 | |
Oakton Temp 10 Thermocouple Thermometer | Thomas Scientific | 1228Y01 | Optional, but can be very useful in identifying the point at which isopentane is freezing. |
For single fiber functional testing | |||
Petri dish | Fisher Scientific | 08-757-11 | |
Sylgard coating | Ellsworth Adhesives | 3-6636 | |
Dissection stereomicroscope | Harvard Apparatus | 693101 | Any other dissection microscope could substitute. |
For cell culture | |||
Sterile laminar flow hood | Thermo Scientific | 51022485 | Any other cell culture hood could substitute. |
Materials | |||
For tissue freezing | |||
Plastic bags/containers | Nasco | B01009WA | |
Thermal safety gloves | Denville | G4162 | |
Face shield | Fisher Scientific | S47640 | |
Long forceps | Fisher Scientific | 12-460-807 | |
Marker | Staples | 125328 | |
For cell culture | |||
Sterile 50 mL conical tubes | Denville | C1060-P | |
PES filter unit, 500 mL, 0.22 µm | Denville | F5227 | |
Sterile forceps | Fisher Scientific | 644320 | |
Ice packs | Fisher Scientific | NC9909223 | |
Insulated Styrofoam box | Polar Tech | 207F | |
Packing tape | Staples | 795570 | |
Reagents | |||
Tissue Freezing | |||
Liquid nitrogen | Airgas | NI NF160LT350 | Store liquid nitrogen in containers designed for low-temperature liquids |
Isopentane (2-methylbutane) | Sigma | M32631-4L | Store Isopentane in a flammable materials cabinet. |
EM fixative (choose one) | The buffers without fixative should also be available, as EM-fixed tissues should be transferred from fixative to buffer after several hours or days if they are not immediately processed for EM. | ||
2.5% glutaraldehyde in 0.1M cacodylate buffer | Electron Microscopy Sciences | 16537-15 | |
Karnovsky's fixative (3% glutaraldehyde + 2% paraformaldehyde in 0.1M phosphate buffer) | Electron Microscopy Sciences | 15732-10 | |
For functional studies (if desired) | |||
Relaxing solution, containing (in mmol/L) | |||
40 BES | Sigma | B9879 | |
10 EGTA | Sigma | E4378 | |
6.56 MgCl2 | Sigma | M8266 | |
5.88 Na-ATP | Sigma | A3377 | |
1.0 DTT | RPI | D11000 | |
46.35 K-propionate | Make a solution by mixing proprionic acid (Sigma P1386) and KOH (Fisher P250) 1:1 | ||
15 creatine phosphate, pH 7.0 | Sigma | P7936 | |
0.4 leupeptin | Calbiochem | 10895 | |
0.1 PMSF | Sigma | P7676 | |
Skinning solution, containing | |||
Relaxing solution (See Above) | |||
0.5% Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
Indicating silica granules | |||
Flat pieces of cork (1 x 1 inch) | Electron Microscopy Sciences | 63305 | |
Glycerol | Sigma | G2025 | |
For cell culture (if desired) | |||
Complete Growth Medium, containing (for 500 mL) | Sterilize by filtering the solution through a 500 mL 0.22 µm PES filter unit. Store at 4°C and use within 1 month. | ||
395 mL of high glucose Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Sigma | D5671 | |
100 mL of fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F6178 | |
5 mL of 100X Penicillin-Streptomycin-Glutamine (PSG) | Sigma | G1146 | |
Storage requriements | |||
See the materials safety data sheet (MSDS) for all other reagents for storage specifications |