Profils MicroRNA d'expression de cellules iPS humaines, l'épithélium pigmentaire rétinien Derived From iPS, et fœtale épithélium pigmentaire rétinien
Summary
Le profil des souches d'origine humaine pluripotentes (iPS), l'épithélium pigmentaire rétinien (EPR) dérivées de l'homme induit-souches pluripotentes (iPS) (iPS-RPE), et RPE fœtale microARN (miARN), ont été comparés.
Abstract
L'objectif de ce rapport est de décrire les protocoles pour comparer le profil des anthropique-souches pluripotentes (iPS), l'épithélium pigmentaire rétinien (EPR) dérivées de cellules iPS humaines (iPS-RPE), et RPE fœtale microRNA (miRNA). Les protocoles comprennent la collecte de l'ARN pour l'analyse par puces à ADN, et l'analyse des données de puces à ADN pour identifier les miARN qui sont exprimés de manière différentielle entre trois types de cellules. Les méthodes de culture de cellules iPS et RPE fœtale sont expliqués. Le protocole utilisé pour la différenciation de l'EPR de iPS humaines est également décrite. La technique d'extraction d'ARN, nous décrivons a été choisie pour permettre une récupération maximale de l'ARN très faible pour une utilisation dans un microréseau miARN. Enfin, voie cellulaire et l'analyse du réseau de données de puces à ADN est expliqué. Ces techniques vont faciliter la comparaison des profils de miARN de trois types de cellules différents.
Introduction
Les cellules souches ont la capacité de se répliquer sans limite et le potentiel de se différencier en n'importe quel type de cellules somatiques. Le développement des techniques de reprogrammer des cellules somatiques en cellules souches pluripotentes a suscité beaucoup d'enthousiasme dans la communauté des chercheurs et des cliniciens, comme l'avènement de la régénération des tissus personnalisé à l'horizon 1. Induire-souches pluripotentes (iPS) présentent les mêmes caractéristiques de potentiel réplicatif illimité et pluripotence comme souches embryonnaires (ES) des cellules tout en contournant les dilemmes éthiques liés à la CES. En outre, les cellules souches provenant de patients ne seront pas stimuler une réponse immunitaire, ce qui augmente considérablement la probabilité de succès des applications thérapeutiques 3.2. Dans des conditions de culture spécifiques, les cellules iPS ont été montrés pour se différencier en plusieurs types différents de cellules in vitro, y compris les cardiomyocytes, les neurones, les cellules bêta pancréatiques, des hépatocytes, et l'épithélium pigmentaire rétinien (RPE) 4-12.
La RPE est une couche de cellules epitheliales spécialisées pigmentés situés à l'arrière de la rétine qui exécute plusieurs fonctions qui sont essentielles pour la santé visuelle et fonction telle que l'absorption de la lumière parasite, la phagocytose des segments externes des photorécepteurs, et le traitement des rétinoïdes pour la production de chromophore visuelle. Le dysfonctionnement de l'EPR en raison de dommages ou maladie affecte profondément la santé des photorécepteurs et la fonction visuelle comme en témoignent les maladies cécitantes qui sont le résultat de la pathologie de l'EPR sous-jacente comme la dégénérescence liée à l'âge (DMLA), la maladie de Stargardt et la rétinite pigmentaire (RP) 13. Traitements vraiment efficaces qui peuvent restaurer la vision n'ont pas été atteints, et le remplacement des RPE malade avec sain RPE peut être la meilleure option pour éviter la perte de vision 14-15. EPR dérivé de cellules iPS (iPS-RPE) est une source possible de cellules pour remplacer l'EPR endommagé. iPS-RPE exprime caracprotéines RPE tic LRAT, CRALBP, PEDF, et RPE65; affiche la classique fortement pigmentée hexagonale RPE morphologie; et exerce des fonctions RPE comme la phagocytose, le traitement rétinoïde, et la sécrétion de 11 – 5,16 rétinienne cis. Toutefois, avant iPS-RPE peut être utilisé en thérapeutique, l'IPS-RPE doit être caractérisée à fond. La compréhension des facteurs qui régissent différenciation RPE est nécessaire d'améliorer le rendement et la pureté des cellules pour être utilisé pour des applications cliniques.
La différenciation cellulaire est le résultat de l'expression des gènes fortement réglementé. Remodelage épigénétique du génome et de la coordination des facteurs de transcription sont requis pour les décisions du destin cellulaire qui se produisent lors de la différenciation et de développement 17. Règlement de message de l'ARN (ARNm) traduction par les microARN (miARN) présente encore un autre niveau de la réglementation qui affecte le destin des cellules 1. MiRNAs sont courtes, ~ 22 nt, longueurs de nucléotides qui soit la traduction suppress parla liaison à la 3 'UTR de l'ARNm ou de cibler l'ARNm de la dégradation. MiRNAs ont été détectés dans pratiquement tous les tissus et à ce jour plus de 2000 microARN humains uniques ont été enregistrés dans la base de données miRBase. Depuis miARN exigent complémentarité partielle de se lier à l'ARNm cible, un seul miARN peut potentiellement se lier à des dizaines ou des centaines de cibles, et vice versa, c'est à dire un seul ARNm peut être visé par plusieurs miARN différents. Cette caractéristique de liaison promiscuité augmente considérablement le niveau de complexité de la réglementation ainsi que le niveau de difficulté de déterminer les fonctions de miARN individuels et le rôle de chacun dans les fonctions cellulaires 18-21. Néanmoins, des études ont montré que les miARN affine l'expression des gènes lors de la différenciation en affectant le statut de méthylation d'ADN 17. Dans une étude plus spécifique de l'EPR, miR-204/211 a été montré pour promouvoir le phénotype épithélial de l'EPR 22. Un autre groupe a analysé le profil miRNAde RPE cours de la différenciation des cellules ES et révélé ensembles distincts de miARN sont exprimés au cours du processus de différenciation 23. En fait, les profils de miARN peuvent clairement distinguer les types de cellules, y compris les cellules souches embryonnaires, des cellules précurseurs et des cellules à différenciation terminale 24,25. Plus de 250 miARN sont exprimés dans la rétine. Sur la base de ces études, nous faisons l'hypothèse que les miARN jouent un rôle important au cours de la différenciation des RPE de iPS.
L'objectif de ce rapport est de décrire les protocoles pour la différenciation des RPE de IMR90-4 cellules iPS, collection de l'ARN pour l'analyse par puces à ADN, et l'analyse des données de puces à ADN pour identifier les miARN qui sont exprimés de manière différentielle entre trois types de cellules, les cellules iPS , iPS-RPE et RPE fœtale. L'ARN total a été extrait à partir de cultures de chaque type de cellule et hybride à une puce à ADN miRNA, contenant des sondes spécifiques pour 1205 miARN humains et 144 miARN viraux. Les résultats de puces à ADN ont été comparerd pour déterminer le miARN ont été exprimés de façon différentielle entre les différents types cellulaires. miARN avec 2 fois ou plus facteur de variation de l'expression ont été sélectionnés pour une analyse plus approfondie. Un logiciel d'analyse miARN a été utilisé pour identifier des cibles potentielles des miARN exprimés de manière différentielle et de générer des réseaux cellulaires régulés par les miARN sélectionnés.
Protocol
Representative Results
Discussion
En conclusion, ce rapport décrit les méthodes utilisées pour la culture de cellules iPS, iPS-RPE, et RPE fœtale. EPR dérivé de iPS sont morphologiquement et fonctionnellement similaire à RPE fœtale. L'IPS-RPE exprime aussi des gènes de RPE caractéristiques dont RPE65, CRALBP, PEDF, et LRAT 16. Pour mieux caractériser ces cellules, l'ARN a été extrait et utilisé pour effectuer l'analyse des microréseaux d'identifier exprimé de manière différentielle miARN. Analyse des intensit…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les opinions exprimées dans le présent article sont celles des auteurs et ne doivent pas être interprétées comme fonctionnaire ou comme reflétant les vues du Département de l'Armée ou le ministère de la Défense.
Cette recherche a été réalisée alors que les auteurs Whitney A. Greene, Alberto Muñiz, et Ramesh R. Kaini tenu un attaché de recherche postdoctorale du Conseil national de recherches à l'USAISR.
analyses de biopuces ont été effectuées par l'Institut de recherche sur le cancer de puces à ADN base la facilité de la Greehey enfants et Département bioinformatique à l'UT Health Science Center à San Antonio.
Ce travail a été soutenu par le Programme de l'armée américaine médecine clinique de réadaptation de la recherche (CRMRP) et militaire du programme de recherche de la médecine opérationnelle (MOMRP).
Materials
| mTeSR1 media + 5X supplement | Stem Cell Technologies | 5850 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M-7154 | |
| Non essential amino acids | Hyclone(Fisher) | SH30853.01 | |
| Knockout serum replacement | Life Technologies | 10828-028 | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | |
| MEM media | Life Technologies | 10370-021 | |
| N1 supplement | Sigma | N-6530-5ML | |
| Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888-1G | |
| Fetal bovine serum | Hyclone(Fisher) | SH3008803HI | |
| Triiodo-l-thyronine sodium salt | Sigma | T6397 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881 | |
| Fetal RPE media RTEGM kit | Life Technologies | 195406 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| Phosphate buffered saline | Hyclone(Fisher) | 10010-023 | |
| Trypsin | Hyclone(Fisher) | 25200-072 | |
| Miltenyi Biotec washing buffer | StemGent | 130-092-987 | |
| Miltenyi Biotec rinsing buffer | StemGent | 130-092-222 | |
| Anti-TRA-1-60 microbead kit | StemGent | 130-095-816 | |
| Miltenyi Biotec cell sorter column | StemGent | 130-021-101 | |
| RNeasy micro kit | Qiagen | 74004 | |
| QIA shredder | Qiagen | 79654 | |
| RNA 6000 Pico LabChip kit | Agilent | G2938-90046 | |
| Human miRNA microarray v16 | Agilent | G4471A |
Referências
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