MicroRNA (מירנה) הפרופילים של גזע אנושי-Induced pluripotent תאים (iPS), אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE) נגזרים מגזע אנושי-Induced pluripotent תאים (iPS) (iPS-RPE), ורשתית של העובר, הושווה.
מטרת דו"ח זה היא לתאר את הפרוטוקולים להשוואת microRNA (מירנה) פרופילים של גזע אנושי-Induced pluripotent תאים (iPS), אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE) שמקורם בתאי iPS האנושי (iPS-RPE), ורשתית של העובר. הפרוטוקולים כוללים אוסף של RNA לניתוח על ידי microarray, וניתוח של נתונים microarray לזהות miRNAs שבאים לידי ביטוי באופן דיפרנציאלי בין שלושה סוגי תאים. השיטות לתרבות של תאי iPS ורשתית של העובר הם הסבירו. הפרוטוקול המשמש לבידול של הרשתית מiPS האנושי מתואר גם. טכניקת הפקת RNA אנו מתארים נבחרה כדי לאפשר התאוששות מקסימלי של RNA הקטן מאוד לשימוש במירנה microarray. לבסוף, מסלול הסלולר ורשת ניתוח של נתוני microarray הוא הסביר. טכניקות אלה תאפשר ההשוואה בין פרופילי מירנה משלושה סוגי תאים שונים.
לתאי גזע יש את היכולת לשכפל ללא הגבלה והפוטנציאל להתמיין לכל סוג תא סומטי. הפיתוח של טכניקות כדי לתכנת מחדש את התאים הסומטיים לתאי גזע pluripotent עורר התרגשות רבה בקהילת המחקר ובקרב רופאים, כמו כניסתו של התחדשות רקמות אישית היא באופק 1. -Induced pluripotent תאי גזע (iPS) להפגין את אותן תכונות של פוטנציאל replicative בלתי מוגבל וpluripotency כגזע עוברי (ES) תאים תוך עקיפת הדילמות האתיות הקשורות לESCs. בנוסף, תאי גזע שמקורם בחולה לא לעורר תגובה חיסונית, מאוד להגדיל את ההסתברות ליישומים טיפוליים המוצלחים 2-3. בתנאי תרבות מסוימים, תאי iPS הוכחו להתמיין לכמה סוגי תאים שונים במבחנה, כוללים שריר לב, תאי עצב, תאים בטא בלבלב, hepatocytes, ואפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE) 4-12.
הרשתית היא שכבה מיוחדת של תאי אפיתל פיגמנט ממוקמים בחלק האחורי של הרשתית שמבצעת מספר פונקציות שהם חיוניים לבריאות ותפקוד חזותיים כגון קליטת אור התועה, phagocytosis של המגזרים החיצוניים קולטי האור, ועיבוד של רטינואידים לייצור של chromophore החזותי. חוסר תפקוד של הרשתית עקב נזק או מחלה משפיע עמוקות על בריאות קולטי אור ותפקוד ראייה כפי שמעיד מחלות המסנוורים שהן התוצאה של פתולוגיה הרשתית הבסיסית כגון ניוון הקשור לגיל מקולרי (AMD), המחלה של Stargardt, ורטיניטיס פיגמנטוזה (RP) 13. טיפולים באמת יעילים שיכול לשחזר את חזון לא הושגו, והחלפה של הרשתית חולה עם הרשתית בריאה עשויה להיות האפשרות הטובה ביותר למנוע אובדן הראייה 14-15. הרשתית נובעת מiPS (iPS-RPE) היא מקור אפשרי של תאים כדי להחליף את הרשתית הפגועה. IPS-הרשתית מבטאת characterisחלבוני הרשתית טיק LRAT, CRALBP, PEDF, וRPE65; מציג את מורפולוגיה המשושה פיגמנט מאוד הקלסית הרשתית; ומבצע פונקציות הרשתית כגון phagocytosis, עיבוד retinoid, והפרשת 11 – 5,16 רשתית cis. עם זאת, לפני IPS-הרשתית יכולה לשמש טיפולית, IPS-הרשתית חייבת להיות מאופיינת באופן יסודי. הבנת הגורמים הקובעים בידול הרשתית יש צורך לשפר את התשואה וטוהר של התאים שישמש ליישומים קליניים.
התמיינות תאים היא התוצאה של ביטוי גנים מוסדרים מאוד. שיפוץ אפיגנטיים של הגנום והתיאום של גורמי שעתוק נדרש להחלטות גורל תא המתרחשות במהלך התמיינות והתפתחות 17. רגולציה של תרגום ההודעה RNA (mRNA) על ידי microRNA (מירנה) להציג עוד רמה של רגולציה המשפיעה על תא גורל 1. MiRNAs קצר, ~ 22 NT, אורכים של נוקלאוטידים כי גם תרגום לדכא ידיהקשירה של UTR '3 של mRNA או למקד את ה-mRNA לשפלה. MiRNAs זוהו כמעט בכל הרקמות ועד כה מעל 2,000 מיקרו RNA האנושי הייחודי נרשם באתר miRBase. מאז miRNAs דורש השלמה חלקית בלבד כדי לאגד את ה-mRNA היעד, מירנה אחד יכולה באופן פוטנציאלי להיקשר לעשרות או מאות מטרות, ולהיפך, כלומר mRNA אחד יכול להיות ממוקדת על ידי מספר miRNAs שונה. מאפיין מחייב מופקר זה מגדיל באופן דרמטי את רמת המורכבות של רגולציה, כמו גם את רמת קושי של קביעת הפונקציות של miRNAs פרט ואת התפקיד כל הצגות בתפקודים תאיים 18-21. עם זאת, מחקרים הראו כי מירנה משכללת ביטוי גנים במהלך בידול על ידי המשפיע על מעמדה מתילציה דנ"א 17. במחקר ספציפי יותר לרשתית, miR-204/211 הוצג כדי לקדם את הפנוטיפ האפיתל של הרשתית 22. קבוצה נוספת ניתחה את פרופיל מירנהשל הרשתית במהלך התמיינות בתאי גזע עובריים וחשפו סטים שונים של מירנה באים לידי ביטוי בתהליך ההתמיינות 23. למעשה, פרופילי מירנה יכולים באופן חד משמעי להבחין בין סוגי תאים, כוללים תאי גזע עובריים, תאים מבשר, ותאי הבדיל סופני 24,25. מעל 250 miRNAs באים לידי ביטוי ברשתית. בהתבסס על מחקרים אלה, אנו משערים כי miRNAs לשחק תפקיד חשוב בהתמיינות של הרשתית משב"ס.
מטרת דו"ח זה היא לתאר את הפרוטוקולים להתמיינות של הרשתית מIMR90-4 תאים iPS, אוסף של RNA לניתוח על ידי microarray, והניתוח של נתונים microarray לזהות miRNAs שבאים לידי ביטוי באופן דיפרנציאלי בין שלושה סוגי תאים, תאי iPS , IPS-הרשתית ורשתית של העובר. RNA סה"כ היה שחולץ מן התרבויות של כל סוג תא והכלאה לmicroarray מירנה, המכיל בדיקות ספציפיות ל1,205 miRNAs אדם ו144 miRNAs הנגיפי. תוצאות microarray היו להשוותד כדי לקבוע אילו miRNAs באו לידי הביטוי באופן דיפרנציאלי בין סוגי התאים השונים. miRNAs עם 2 קיפול או שינוי של פי יותר בביטוי נבחרו לניתוח נוסף. תוכנת ניתוח מירנה שימשה כדי לזהות מטרות פוטנציאליות של miRNAs הביע באופן דיפרנציאלי וליצור רשתות סלולריות מוסדרים על ידי miRNAs שנבחר.
לסיכום, דו"ח זה מתאר את השיטות המשמשות לתאי iPS תרבות, IPS-הרשתית, ורשתית של העובר. הרשתית נובעת מiPS הן מורפולוגית ופונקציונלית דומות לרשתית של העובר. IPS-הרשתית גם מבטאת גנים הרשתית אופייניים כולל RPE65, CRALBP, PEDF, וLRAT 16. כדי להמשיך ולאפיין את התאים האלה, RNA הופק ומשמש לב?…
The authors have nothing to disclose.
הדעות או טענות הכלולות במסמך זה הן התצוגות אישי של הכותבים ואינם להתפרש רשמי או כפי שמשקפים את הדעות של מחלקת הצבא או משרד ביטחון.
מחקר זה בוצע בזמן שהמחברים יטני א גרין, אלברטו מוניז, וראמש ר Kaini קיימו המועצה הלאומית למחקר דוקטורים Associateship מחקר בUSAISR.
מבחני microarray בוצעו על ידי מתקן המכון לחקר סרטן Microarray Core הילדים Greehey וביואינפורמטיקה המחלקה ב UT למדעי בריאות במרכז סן אנטוניו.
עבודה זו נתמכה על ידי תכנית הצבא האמריקאי לרפואה הקלינית שיקומית מחקר (CRMRP) ותכנית צבאית לרפואה תפעולית מחקר (MOMRP).
mTeSR1 media + 5X supplement | Stem Cell Technologies | 5850 | |
DMEM/F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
2-Mercaptoethanol | Sigma | M-7154 | |
Non essential amino acids | Hyclone(Fisher) | SH30853.01 | |
Knockout serum replacement | Life Technologies | 10828-028 | |
Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | |
MEM media | Life Technologies | 10370-021 | |
N1 supplement | Sigma | N-6530-5ML | |
Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
Hydrocortisone | Sigma | H0888-1G | |
Fetal bovine serum | Hyclone(Fisher) | SH3008803HI | |
Triiodo-l-thyronine sodium salt | Sigma | T6397 | |
Sodium hydroxide | Sigma | S5881 | |
Fetal RPE media RTEGM kit | Life Technologies | 195406 | |
Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
Phosphate buffered saline | Hyclone(Fisher) | 10010-023 | |
Trypsin | Hyclone(Fisher) | 25200-072 | |
Miltenyi Biotec washing buffer | StemGent | 130-092-987 | |
Miltenyi Biotec rinsing buffer | StemGent | 130-092-222 | |
Anti-TRA-1-60 microbead kit | StemGent | 130-095-816 | |
Miltenyi Biotec cell sorter column | StemGent | 130-021-101 | |
RNeasy micro kit | Qiagen | 74004 | |
QIA shredder | Qiagen | 79654 | |
RNA 6000 Pico LabChip kit | Agilent | G2938-90046 | |
Human miRNA microarray v16 | Agilent | G4471A |