ヒトiPS細胞のマイクロRNA発現プロファイル、IPから派生網膜色素上皮、および胎児の網膜色素上皮
Summary
マイクロRNA（miRNAを）人為-多能性幹（IPS）細胞（IPS-RPE）、および胎児RPE由来のヒト誘起多能性幹（IPS）細胞、網膜色素上皮（RPE）のプロファイルは、比較した。
Abstract
このレポートの目的は、マイクロRNA（miRNAを）ヒトiPS細胞（IPS-RPE）に由来する人為-多能性幹（IPS）細胞、網膜色素上皮（RPE）、および胎児RPEのプロファイルを比較するためのプロトコルを記述することである。プロトコルは、マイクロアレイによる解析のためのRNAの収集、および差次3種の細胞型間で発現されるmiRNAを同定するためのマイクロアレイデータの分析を含む。 iPS細胞や胎児RPEの培養のための方法を説明します。ヒトiPSからのRPEの分化に使用されるプロトコルにも記載されている。我々が記述するRNA抽出技術は、miRNAのマイクロアレイにおける使用のための非常に小さなRNAの最大の回収を可能にするように選択した。最後に、マイクロアレイデータの細胞経路およびネットワーク分析を説明する。これらの技術は、3つの異なる細胞型のmiRNAプロファイルの比較を容易にする。
Introduction
幹細胞は無制限に複製する能力、および任意の体細胞型に分化する可能性を有する。パーソナライズされた組織再生の出現が地平線1にあるように多能性幹細胞への体細胞を再プログラムするための技術の開発は、研究コミュニティ内や臨床医の間で大きな興奮を誘発しました。誘起多能性幹（IPS）細胞のESCに関連する倫理的ジレンマを回避しながら、胚性幹（ES）細胞のような無限の複製能力と多能性の同じ特徴を示す。加えて、患者由来の幹細胞が大幅に成功した治療への応用2-3の確率を増大させる、免疫応答を刺激しないであろう。特定の培養条件下で、iPS細胞は、心筋細胞、ニューロン、膵臓β細胞、肝細胞、および網膜色素上皮（RPを含む、インビトロでいくつかの異なる細胞型に分化することが示されているE）を4月12日 。
RPEは、生産に特化したような光受容体外側セグメントの迷光、食作用の吸収などの視覚的な健康と機能に不可欠ないくつかの機能を実行、網膜の奥に位置して色素上皮細胞層、およびレチノイドの処理である視覚発色団の。例えば、加齢性黄斑変性症（AMD）、シュタルガルト病、及び網膜色素変性症（RP）などの下地RPE病理の結果である失明疾患によって証明されるようによる損傷または疾患にRPEの機能不全が深く、感光体の健康および視覚機能に影響を与え13。視力を回復することができ、本当に効果的な治療が達成されておらず、健全なRPEと病気のRPEの交換はビジョン14〜15の損失を防止するための最良の選択肢かもしれません。のiPS（IPS-RPE）に由来するRPEが破損し、RPEを置き換えるために、細胞の可能性のあるソースです。 IPS-RPEはcharacterisを表現TICのRPEタンパク質LRAT、CRALBP、PEDF、及びRPE65;古典高度に着色六角形のRPE形態を表示します。 シスレチナール5,16 -など食作用、レチノイド処理、および11の分泌としてRPE機能を実行する。 IPS-RPEを治療的に使用することができる前に、しかし、IPS-RPEを徹底的に特徴づけされなければならない。 RPE分化を支配する要因を理解することは、臨床用途に使用する細胞の収率および純度を向上させる必要がある。
細胞分化は、高度に調節される遺伝子発現の結果である。転写因子のゲノムとの連携のエピジェネティックな改造は、分化および発生17中に発生する細胞運命決定のために必要とされる。マイクロRNA（miRNAを）によるメッセージRNA（mRNA）の翻訳の調節は、細胞運命1に影響を与える規制のさらに別のレベルを示します。 miRNAは、〜22、NT、によって翻訳を抑制するいずれかのヌクレオチドの長さが不足しているmRNAの3 'UTRに結合するか、分解のためにmRNAをターゲットにしています。 miRNAは、事実上すべての組織で検出されており、現在までに2000以上のユニークな人間のマイクロRNAは、miRBaseデータベースに登録されています。 すなわち 、単一のmRNAは、いくつかの異なるmiRNAによって標的とすることができる。miRNAは、標的mRNAと結合することが部分的にしか相補性を必要とするので、一つのmiRNAは、潜在的に数十あるいは数百の目標、およびその逆に結合することができる。この無差別結合特性を飛躍的に規制の複雑さのレベルだけでなく、個々のmiRNAの機能を決定することの難しさのレベルと役割の細胞機能18〜21の各プレーを向上させます。それにもかかわらず、研究は、miRNAがDNAメチル化状態17に影響を与えることによって分化の間の遺伝子発現を洗練することが示されている。 RPEへのより具体的な研究において、miR-204/211はRPE 22の上皮表現型を促進することが示された。別のグループは、miRNAプロファイルを分析したRPEのES細胞からの分化の間およびmiRNAの別個のセットを明らかにしたが、分化プロセス23の間に発現される。実際、miRNAプロファイルは、明確にES細胞、前駆細胞、および分化細胞24,25を含む細胞タイプを区別することができる。 250以上のmiRNAは、網膜で発現される。これらの研究に基づき、我々は、miRNAがIPからのRPEの分化の際に重要な役割を果たしていると仮定した。
このレポートの目的は、IMR90-4 iPS細胞は、マイクロアレイによる解析のためにRNAを収集し、示差的3種の細胞型間で発現されるmiRNAを同定するためのマイクロアレイデータの解析、iPS細胞からのRPEの分化のためのプロトコルを記述することである、IPS-RPEおよび胎児RPE。総RNAを、各細胞型の培養物から抽出され、1205のヒトmiRNA及び144ウイルスのmiRNAに特異的なプローブを含む、miRNAのマイクロアレイにハイブリダイズさせた。マイクロアレイの結果を比較した示差的に異なる細胞型間で発現されたmiRNAを決定するためにdを。 2倍以上の発現のより大きな倍率変化を有するmiRNAは、さらなる分析のために選択した。 miRNAの解析ソフトが差次的に発現miRNAの潜在的な標的を同定するために、選択したmiRNAによって調節セルラー·ネットワークを生成するために使用された。
Protocol
Representative Results
Discussion
結論として、この報告書は、文化iPS細胞、IPS-RPE、胎児RPEするために使用される方法を説明します。 IPからの派生のRPEは、形態学的および機能的に胎児RPEに似ています。 IPS-RPEはまた、RPE65、CRALBP、PEDF、及びLRAT 16を含む特徴的なRPE遺伝子を発現する。さらに、これらの細胞を特徴付けるために、RNAを抽出し、示差的に発現するmiRNAを同定するためにマイクロアレイ解析を実行するため?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ここに記載されている意見やアサーションは、著者の個人ビューであり、公式または陸軍省や国防総省の見解を反映するものとして解釈されるべきではない。
著者ホイットニーA.グリーン、アルベルト·ムニーズ、とラメシュR. KainiがUSAISRで米国学術研究会議ポスドク研究Associateshipを開催しながら、本研究を実施した。
マイクロアレイアッセイは、UTの健康科学センターサンアントニオでGreehey小児がん研究所マイクロアレイ基盤施設およびバイオインフォマティクス部門によって行われた。
この作品は、米軍の臨床リハビリテーション医学研究プログラム（CRMRP）と軍事運用医学研究プログラム（MOMRP）によってサポートされていました。
Materials
| mTeSR1 media + 5X supplement | Stem Cell Technologies | 5850 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M-7154 | |
| Non essential amino acids | Hyclone(Fisher) | SH30853.01 | |
| Knockout serum replacement | Life Technologies | 10828-028 | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | |
| MEM media | Life Technologies | 10370-021 | |
| N1 supplement | Sigma | N-6530-5ML | |
| Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888-1G | |
| Fetal bovine serum | Hyclone(Fisher) | SH3008803HI | |
| Triiodo-l-thyronine sodium salt | Sigma | T6397 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881 | |
| Fetal RPE media RTEGM kit | Life Technologies | 195406 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| Phosphate buffered saline | Hyclone(Fisher) | 10010-023 | |
| Trypsin | Hyclone(Fisher) | 25200-072 | |
| Miltenyi Biotec washing buffer | StemGent | 130-092-987 | |
| Miltenyi Biotec rinsing buffer | StemGent | 130-092-222 | |
| Anti-TRA-1-60 microbead kit | StemGent | 130-095-816 | |
| Miltenyi Biotec cell sorter column | StemGent | 130-021-101 | |
| RNeasy micro kit | Qiagen | 74004 | |
| QIA shredder | Qiagen | 79654 | |
| RNA 6000 Pico LabChip kit | Agilent | G2938-90046 | |
| Human miRNA microarray v16 | Agilent | G4471A |
Referências
- Yu, Z., et al. miRNAs regulate stem cell self-renewal and differentiation. Front Genet. 3, 191 (2012).
- Romano, G., et al. A commentary on iPS cell biology: Potential applications in autologous tissue and cell transplantation, development of new models for the study of human pathological conditions and drug screening. J Cell Physiol. 229, 148-152 (2014).
- Almeida, P. E., et al. Immunogenicity of pluripotent stem cells and their derivatives. Circ Res. 112, 549-561 (2013).
- Buchholz, D. E., et al. Derivation of functional retinal pigmented epithelium from induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27, 2427-2434 (2009).
- Kokkinaki, M., et al. Human induced pluripotent stem-derived retinal pigment epithelium (RPE) cells exhibit ion transport, membrane potential, polarized vascular endothelial growth factor secretion, and gene expression pattern similar to native RPE. Stem Cells. 29, 825-835 (2011).
- Bharti, K., et al. The new paradigm: retinal pigment epithelium cells generated from embryonic or induced pluripotent stem cells. Pigment Cell Melanoma Res. 24, 21-34 (2011).
- Park, I. H., et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451, 141-146 (2008).
- Pera, M. F. Stem cells. A new year and a new era. Nature. 451, 135-136 (2008).
- Subba Rao, M., et al. Thinking outside the liver: Induced pluripotent stem cells for hepatic applications. World J Gastroenterol. 19, 3385-3396 (2013).
- Yoshida, Y., Yamanaka, S. iPS cells: a source of cardiac regeneration. J Mol Cell Cardiol. 50, 327-332 (2011).
- Lee, K. S., et al. Human sensory neurons derived from induced pluripotent stem cells support varicella-zoster virus infection. PLoS One. 7, (2012).
- Alipio, Z., et al. Reversal of hyperglycemia in diabetic mouse models using induced-pluripotent stem (iPS)-derived pancreatic beta-like cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 13426-13431 (2010).
- la Cour, M., Tezel, T. The retinal pigment epithelium. Adv Organ Biol. 10, 253-272 (2005).
- Carr, A. J., et al. Protective effects of human iPS-derived retinal pigment epithelium cell transplantation in the retinal dystrophic rat. PLoS One. 4, (2009).
- Schwartz, S. D., et al. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. Lancet. 379, 713-720 (2012).
- Muniz, A., et al. Retinoid uptake, processing and secretion in human iPS-RPE support the visual cycle. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, 198-209 (2014).
- Leonardo, T. R., et al. The functions of microRNAs in pluripotency and reprogramming. Nat Cell Biol. 14, 1114-1121 (2012).
- Arora, A., et al. Prediction of microRNAs affecting mRNA expression during retinal development. BMC Dev Biol. 10, (2010).
- Huntzinger, E., Izaurralde, E. Gene silencing by microRNAs: contributions of translational repression and mRNA decay. Nat Rev Genet. 12, 99-110 (2011).
- Mallanna, S. K., Rizzino, A. Emerging roles of microRNAs in the control of embryonic stem cells and the generation of induced pluripotent stem cells. Dev Biol. 344, 16-25 (2010).
- Guo, H., et al. Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels. Nature. 466, 835-840 (2010).
- Adijanto, J., et al. Microphthalmia-associated transcription factor (MITF) promotes differentiation of human retinal pigment epithelium (RPE) by regulating microRNAs-204/211 expression. J Biol Chem. 287, 20491-20503 (2012).
- Hu, G., et al. Identification of miRNA signatures during the differentiation of hESCs into retinal pigment epithelial cells. PLoS One. 7, (2012).
- Wilson, K. D., et al. MicroRNA profiling of human-induced pluripotent stem cells. Stem Cells Dev. 18, 749-758 (2009).
- Neveu, P., et al. MicroRNA profiling reveals two distinct p53-related human pluripotent stem cell states. Cell Stem Cell. 7, 671-681 (2010).
- Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, 3612-3624 (2006).
- Qiagen, miRNeasy Mini Handbook. Sample and Assay Technologies. , (2013).
- . Microarray System with miRNA Complete Labeling and Hyb Kit. Agilent Technologies. , (2011).
- . Maintenance of hESCs and hiPSCs in mTESR1 and mTESR2. Stem Cell Technologies. , (2010).
- . The Analysis of DNA or RNA using its wavelengths: 230 nm, 260 nm, 280 nm. About Biotechnology. , (2013).
