인간 iPS 세포의 마이크로 RNA 발현 프로파일, IP의 유래 망막 색소 상피 세포, 태아의 망막 색소 상피
Summary
마이크로 RNA (miRNA의) 인간 유도 만능 줄기 (IPS) 세포 (IPS-RPE) 태아 RPE에서 파생 된 인간 유도 만능 줄기의 프로파일 (IPS) 세포, 망막 색소 상피 (RPE)를, 비교 하였다.
Abstract
이 보고서의 목적은 마이크로 RNA (miRNA의) 인간 iPS 세포 (IPS-RPE)에서 파생 된 인간 유도 만능 줄기 (IPS) 세포, 망막 색소 상피 (RPE) 태아 RPE의 프로파일을 비교하기위한 프로토콜을 설명하는 것입니다. 프로토콜은 마이크로 어레이로 분석 RNA의 수집 및 차동 세 종류의 세포 사이에 표현의 miRNAs를 확인하는 마이크로 어레이 데이터의 분석을 포함한다. iPS 세포와 태아의 망막 색소 상피의 문화에 대한 방법이 설명되어 있습니다. 인간의 IPS에서 RPE의 차별화를 위해 사용되는 프로토콜은 설명한다. 우리가 설명 RNA 추출 기술은 miRNA의 마이크로 어레이에 사용하기위한 매우 작은 RNA의 최대 복구를 허용하도록 선택되었다. 마지막으로, 셀룰러 통로 및 마이크로 어레이 데이터의 네트워크 분석을 설명한다. 이러한 기술은 세 가지 서로 다른 유형의 세포의 miRNA 프로파일의 비교를 용이하게 할 것이다.
Introduction
줄기 세포는 한계 및 체세포 형태로 분화 할 가능성없이 복제하는 능력이있다. 개인 조직 재생의 출현은 수평선 1에 그대로 만능 줄기 세포로 체세포를 재 프로그램하는 기술의 개발, 지역 사회 연구와 임상의 사이에 큰 흥분을 유발하고있다. 줄이고 ESCs와 관련된 윤리적 딜레마를 회피하면서 유도 만능 줄기 (IPS) 세포 (ES) 세포 배아 줄기으로 무제한 증식하는 잠재력과 능성의 동일한 기능을 나타낸다. 또, 환자 유래의 줄기 세포는 매우 성공적인 치료 응용 2-3의 확률을 증가, 면역 반응을 자극하지 않을 것이다. 특정 배양 조건에서, iPS 세포는 심근, 신경 세포, 췌장 베타 세포, 간세포, 망막 색소 상피 세포 (RP 등의 체외에서 여러 가지 다른 종류의 세포로 분화하는 것으로 나타났다E) 4-12.
RPE는 생산 전문 같은 감광체 외측 세그먼트 미광, 식균의 흡수와 같은 카메라 기능과 건강에 필수적인 여러 가지 기능을 수행 망막의 뒤쪽에 위치하고 색소 상피 세포의 층 및 레티노이드 가공 발색단의. 연령 관련 황반 변성 (AMD), 스타 르가 르트 병, 및 망막 색소 상피 변성증 (RP)와 같은 기본 RPE 병리의 결과 눈부신 질병에 의해 입증 손상 또는 질병에 RPE의 장애 뿌리깊은 광 수용체의 건강과 시각 기능에 영향을 미치는 13. 비전을 복원 할 수 있습니다 참으로 효과적인 치료법이 달성되지 않은, 건강한 RPE와 병에 걸린 RPE의 교체는 비전 14-15의 손실을 방지하는 가장 좋은 옵션이 될 수 있습니다. 의 IPS (IPS-RPE)에서 파생 된 RPE는 손상된 RPE를 대체하는 세포의 가능한 소스입니다. IPS-RPE는 비슷한 특징을 표현TIC RPE 단백질 LRAT, CRALBP, PEDF 및 RPE65; 고전 높은 색칠 육각 RPE의 형태를 표시합니다; CIS 망막 5,16 -와 같은 식균 작용, 레티노이드 처리, 및도 11의 분비와 같은 RPE 기능을 수행한다. IPS-RPE는 치료를 사용하기 전에 그러나, IPS-RPE 철저을 특징으로합니다. RPE의 분화를 제어하는 요인을 이해하는 것은 임상 응용에 사용되는 세포의 수율 및 순도를 향상시킬 필요가있다.
세포 분화는 고도로 조절 유전자 발현의 결과이다. 전사 인자의 게놈과 조정의 성적인 리모델링은 차별화 및 개발 (17) 중에 발생하는 세포의 운명 결정에 필요합니다. 마이크로 RNA (miRNA의)에 의해 메시지 RNA (mRNA의) 번역의 규정은 세포의 운명 1에 영향을 미치는 규제의 또 다른 레벨을 제공합니다. 의 miRNAs는 짧은 ~ 22 NT, 뉴클레오티드의 길이가 억제 번역에 의해 하나의 mRNA의 3 'UTR에 결합 또는 변형의 mRNA를 표적으로한다. 의 miRNAs는 거의 모든 조직에서 검출 된 현재까지 2,000 개 이상의 독특한 인간 마이크로 RNA는 miRBase 데이터베이스에 등록되었습니다. 즉, 하나의 mRNA는 여러 가지의 miRNA 대상이 될 수있는 miRNA 대상의 mRNA에 결합하는 부분적인 보완을 요구하기 때문에, 하나의 miRNA의 가능성이 수십 또는 수백 개의 대상, 그 반대에 바인딩 할 수 있습니다. 이러한 무차별 결합 특성이 극적으로 규제의 복잡성 수준뿐만 아니라 개인의 miRNAs의 기능을 결정 난이도와 역할 세포 기능 18-21에서 각 플레이를 증가시킨다. 그럼에도 불구하고, 연구의 miRNA는 DNA 메틸화 상태 (17)에 영향을 미치는로 분화시 유전자 발현을 정련하는 것으로 나타났습니다. RPE에 대한보다 구체적인 연구에서 miR-204/211은 RPE (22)의 상피 표현형을 촉진하기 위해 표시했다. 다른 그룹은 miRNA의 프로파일을 분석RPE의 ES 세포로부터 분화시와의 miRNA의 독특한 세트를 밝혔다는 분화 과정 23시 표현된다. 사실, miRNA의 프로파일은 명확 ES 세포, 전구 세포, 그리고 말단 분화 세포 24,25 포함한 세포 유형을 구분할 수있다. 250의 miRNAs는 망막로 표현된다. 이러한 연구에 기초하여, 우리의 miRNA가 IP의 망막 색소 상피의 분화 과정에 중요한 역할을한다는 가설을 세웠다.
이 보고서의 목적은 IMR90-4 IP의 RPE의 차별화를위한 프로토콜을 설명하는 것입니다 세포, 마이크로 어레이로 분석 RNA의 수집 및 차동 세 종류의 세포 사이에 표현의 miRNAs, iPS 세포를 식별하는 마이크로 어레이 데이터의 분석 , IPS-RPE 및 태아 RPE. 전체 RNA는 각 세포 유형의 배양으로부터 추출하고 1,205 인간의 miRNAs 144 바이러스의 miRNAs 특정 프로브를 함유하는 miRNA의 마이크로 어레이에 혼성화시켰다. 마이크로 어레이 결과를 비교 하였다의 miRNA가 차별적으로 다른 종류의 세포들로 표현 된 결정 D. 2 배 또는 식의 큰 배 변화의 miRNAs는 추가 분석을 위해 선택되었다. miRNA의 분석 소프트웨어 프로그램은 차등 발현 된 miRNAs의 잠재적 표적을 식별하고 선택의 miRNAs 의해 규제 셀룰러 네트워크를 생성하기 위해 사용되었다.
Protocol
Representative Results
Discussion
결론적으로,이 보고서는 문화 iPS 세포를 사용하는 방법, IPS-RPE, 태아 RPE에 대해 설명합니다. 만능 줄기에서 파생 된 RPE는 형태 학적 및 기능적으로 태아의 망막 색소 상피와 비슷합니다. IPS-RPE는 RPE65, CRALBP, PEDF 및 LRAT 16 등의 특성 RPE 유전자를 표현한다. 추가로 이들 세포를 특성화하기 위해, RNA를 추출하고 차분 miRNA의 발현을 확인하기 위해 마이크로 어레이 분석을 수행하는 데 사용되었?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
여기에 포함 된 의견이나 주장은 저자의 개인 전망이며, 공식 또는 육군의 부 또는 국방부의 의견을 반영하는 것으로 해석되어서는 안됩니다.
저자 휘트니 A. 그린, 알베르토 Muñiz 및 라 메쉬 R. Kaini가 USAISR에 국가 연구위원회 박사 학위 취득 후 연구 Associateship를 개최하면서이 연구를 수행 하였다.
마이크로 어레이 분석은 Greehey 어린이 암 연구소 마이크로 어레이 핵심 시설 및 UT 건강 과학 센터 샌 안토니오에서 생물 정보학 부서에 의해 수행되었다.
이 작품은 미국 육군 임상 재활 의학 연구 프로그램 (CRMRP) 및 군사 운영 의학 연구 프로그램 (MOMRP)에 의해 지원되었다.
Materials
| mTeSR1 media + 5X supplement | Stem Cell Technologies | 5850 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M-7154 | |
| Non essential amino acids | Hyclone(Fisher) | SH30853.01 | |
| Knockout serum replacement | Life Technologies | 10828-028 | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | |
| MEM media | Life Technologies | 10370-021 | |
| N1 supplement | Sigma | N-6530-5ML | |
| Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888-1G | |
| Fetal bovine serum | Hyclone(Fisher) | SH3008803HI | |
| Triiodo-l-thyronine sodium salt | Sigma | T6397 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881 | |
| Fetal RPE media RTEGM kit | Life Technologies | 195406 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| Phosphate buffered saline | Hyclone(Fisher) | 10010-023 | |
| Trypsin | Hyclone(Fisher) | 25200-072 | |
| Miltenyi Biotec washing buffer | StemGent | 130-092-987 | |
| Miltenyi Biotec rinsing buffer | StemGent | 130-092-222 | |
| Anti-TRA-1-60 microbead kit | StemGent | 130-095-816 | |
| Miltenyi Biotec cell sorter column | StemGent | 130-021-101 | |
| RNeasy micro kit | Qiagen | 74004 | |
| QIA shredder | Qiagen | 79654 | |
| RNA 6000 Pico LabChip kit | Agilent | G2938-90046 | |
| Human miRNA microarray v16 | Agilent | G4471A |
Referências
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