Method Article

Perfis de expressão de microRNA iPS Human Cells, Retinal Pigment Epithelium Derivado de Ips, e Fetal Retinal Pigment Epithelium

DOI:

10.3791/51589

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June 24th, 2014

 ,  ,  ,  , 
1Ocular Trauma, U.S. Army Institute of Surgical Research, JBSA Fort Sam Houston

In This Article

Summary

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O microRNA (miRNA) perfis de tronco humanas pluripotentes induzidas por células (iPS), epitélio pigmentar da retina (RPE) derivadas humana induzida por células-tronco pluripotentes (iPS) (IPS-RPE) e RPE fetal, foram comparados.

Abstract

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O objetivo deste relato é descrever os protocolos para comparar o microRNA (miRNA) perfis de humana induzida por células-tronco pluripotentes (iPS), epitélio pigmentar da retina (RPE) derivadas de células iPS humanas (iPS-RPE) e RPE fetal. Os protocolos incluem a recolha de RNA para análise de microarray, e a análise de dados de microarrays para identificar miRNAs que são diferencialmente expressos entre os três tipos de células. Os métodos para cultura de células iPS e RPE fetal são explicados. O protocolo utilizado para a diferenciação de RPE de iPS humana também é descrito. A técnica de extracção de RNA descrevemos foi seleccionado para permitir a recuperação máxima de ARN muito pequena para ser utilizado em um microarray miARN. Finalmente, via celular e análise de redes de dados microarray é explicado. Estas técnicas vão facilitar a comparação dos perfis de miRNA de três tipos de células diferentes.

Introduction

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As células estaminais têm a capacidade de se replicar sem limite e o potencial para se diferenciar em qualquer tipo de célula somática. O desenvolvimento de técnicas para reprogramar células somáticas em células-tronco pluripotentes suscitou grande entusiasmo na comunidade científica e entre os médicos, como o advento da regeneração do tecido personalizado está no horizonte 1. Induzido por células-tronco pluripotentes (iPS) apresentam as mesmas características do potencial replicativo ilimitado e pluripotência como células-tronco embrionárias (ES), contornando os dilemas éticos associados à CES. Além disso, as células estaminais derivadas de pacientes não ....

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Protocol

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1. Preparação de Culturas Reagentes e placas de cultura

  1. mídia mTeSR1: Preparar mídia mTeSR1 acordo com as instruções do fabricante. Descongelar 100 ml de suplemento mTeSR1 5x durante a noite a 4 ° C. Adicione os 100 ml de suplemento mTeSR1 5x para 400 ml de mTeSR1 mídia basais e misture bem. Este meio é estável a 4 ° C durante até 2 semanas e à temperatura de -20 ° C durante 6 meses.
  2. Meios de diferenciação: Preparar meios de diferenciação em DMEM/F12 para produzir 0,1 mM β-mercaptoetanol, 0,1 mM de aminoácidos não essenciais, 2,0 mM de L-glutamina, 10% de soro de knockout, e 10 ug / ml de gentamicina.
  3. mídia iPS-EPR: Preparar mídia iPS-R....

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Results

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células iPS (Figura 1A) foram cultivadas em condições de diferenciação para induzir a diferenciação em células iPS-RPE. O iPS-RPE exibiu clássico fenótipo de RPE hexagonal morfologia das células pigmentadas (Figura 1B), semelhante ao RPE fetal (Figura 1C).

Para entender melhor o papel que pode desempenhar miRNA durante o processo de diferenciação de iPS a iPS-EPR, análise de microarray de expressão miRNA foi conduzido. O RNA total foi coleta.......

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Discussion

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Em conclusão, este relatório descreve os métodos utilizados para a cultura de células iPS, iPS-RPE e RPE fetal. RPE derivado do iPS são morfológica e funcionalmente similares ao RPE fetal. O iPS-RPE também expressa genes RPE característicos incluindo RPE65, CRALBP, PEDF e LRAT 16. Para melhor caracterizar estas células, o RNA foi extraído e utilizado para realizar a análise de microarray para identificar diferencialmente expressos miRNA. A análise das intensidades de sinal revelou que foi detectado o maior nú.......

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Disclosures

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Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgements

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As opiniões ou afirmações contidas neste documento são os pontos de vista particulares de seus autores e não devem ser interpretadas como funcionário ou como refletindo os pontos de vista do Ministério do Exército ou do Departamento de Defesa.

Esta pesquisa foi realizada enquanto os autores Whitney A. Greene, Alberto Muniz, e Ramesh R. Kaini realizou uma Pós-Investigação Associateship Conselho Nacional de Pesquisa da USAISR.

Os ensaios foram realizados por Microarray Facility Cancer Research Institute Microarray Núcleo do Greehey Crianças e Bioinformática Departamento da UT Health Science Center San Antonio. <....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Meio mTeSR1 + suplemento 5XStem Cell Technologies5850
DMEM/F12Life Technologies11330-032
2-β-mercaptoetanolSigmaM-7154
Aminoácidos não essenciaisHyclone(Fisher)SH30853.01
Substituição do soro knockoutLife Technologies10828-028
Gentamicina Life Technologies15750-060
Mídia MEMLife Technologies10370-021
N1 suplementoSigmaN-6530-5ML
TaurinaSigmaT-8691-25G
HidrocortisonaSigmaH0888-1G
Soro bovino fetalHyclone (Fisher)SH3008803HI
Sal de sódio triiodo-l-tironinaSigmaT6397
Hidróxido de sódioSigmaS5881
Mídia RPE fetal Kit RTEGMLife Technologies195406
DispaseLife Technologies17105-041
MatrigelBD Biosciences354277
Fosfato tamponado solução salinaHyclone (Fisher)10010-023
TripsinaHyclone(Fisher)25200-072
Miltenyi Biotec tampão de lavagemStemGent130-092-987
Miltenyi Biotec tampão de enxágueStemGent130-092-222
Kit de microesferas Anti-TRA-1-60StemGent130-095-816
Coluna classificadora de células Miltenyi BiotecStemGent130-021-101
Micro kit RNeasyQiagen74004
QIA trituradorQiagen79654
RNA 6000 Pico LabChip kitAgilentG2938-90046
Microarray de miRNA humano v16AgilentG4471A

References

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  1. Yu, Z., et al. miRNAs regulate stem cell self-renewal and differentiation. Front Genet. 3, 191 (2012).
  2. Romano, G., et al. A commentary on iPS....

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MicroRNA ExpressioniPS CellsRetinal Pigment EpitheliumFetal RPERNA ExtractionMicroarray AnalysisPathway AnalysisCell DifferentiationCell CultureFlow Cytometry

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