Профили микроРНК выражение человеческой плюрипотентных клеток, пигментного эпителия сетчатки, полученных из IPS, и плода пигментного эпителия сетчатки
Summary
МикроРНК (микроРНК) профили антропогенного-плюрипотентных стволовых (плюрипотентных) клеток, пигментный эпителий сетчатки (ПЭС), полученные из стебля антропогенного-плюрипотентные (IPS) клеток (IPS-ПЭС), и плода ПЭС, были сопоставлены.
Abstract
Цель данного доклада является описание протоколов для сравнения микроРНК (микроРНК) профили из стебля антропогенного-плюрипотентные (IPS) клеток, пигментный эпителий сетчатки (ПЭС), полученных от человека плюрипотентных клеток (IPS-РПЭ) и плода РПЭ. Протоколы включают коллекцию РНК для анализа методом микрочипов, а также анализ данных микрочипов для выявления микроРНК, которые разному экспрессируются среди трех типов клеток. Методы культуры плюрипотентных клеток и плода ПЭС объясняются. Протокол, используемый для дифференциации ПЭС от человека IPS также описывается. Методика экстракции РНК мы описываем была выбрана, чтобы позволить максимальное восстановление очень малых РНК для использования в микрочипов микроРНК. Наконец, сотовой пути и сеть анализ микрочипов данных объясняется. Эти методы будут способствовать сравнение профилей микроРНК трех различных типов клеток.
Introduction
Стволовые клетки обладают способностью к репликации без ограничения и потенциал дифференцироваться в любой соматической типа клеток. Развитие методов перепрограммировать соматические клетки в плюрипотентные стволовые клетки уже вызвали большой ажиотаж в научно-исследовательского сообщества и среди врачей, так как появление персонализированной регенерации тканей на горизонте 1. Индуцированные-плюрипотентные стволовые (IPS) клетки обладают теми же функциями неограниченного репликативного потенциала и плюрипотентности, как эмбриональных стволовых (ES) клетки ограниченной этическими дилеммами, связанные с ЭСК. Кроме того, пациент стволовые клетки не будут стимулировать иммунный ответ, что значительно увеличивает вероятность успешных терапевтических применений 2-3. При определенных условиях культивирования, плюрипотентных клеток, как было показано дифференцироваться в нескольких различных типов клеток в пробирке, в том числе кардиомиоцитов, нейронов, панкреатических бета-клеток, гепатоцитов и пигментного эпителия сетчатки (RPЕ) 4-12.
RPE является специализированным слой пигментных эпителиальных клеток, расположенных в задней части сетчатки, которая выполняет несколько функций, которые необходимы для здоровья глаз и функции, такие как поглощение рассеянного света, фагоцитоз из наружных сегментов фоторецепторов, и обработка ретиноидов для производства визуального хромофора. Дисфункция ПЭС из-за повреждения или болезни глубоко влияет на здоровье фоторецепторов и зрительные функции, о чем свидетельствует, слепящих глаза болезней, которые являются результатом основного НПП патологии, такие как возрастной макулярной дегенерации (ВМД), болезни Штаргардта, и пигментный ретинит (RP) 13. Действительно эффективные методы лечения, которые могут восстановить зрение, не были достигнуты, и замена больного ПЭС со здоровой РПЭ может быть лучшим вариантом, чтобы предотвратить потерю зрения 14-15. НПП происходит от IPS (IPS-РПЭ) является возможным источником клеток для замены поврежденного НПП. IPS-НПП выражает характик белки ПЭС LRAT, CRALBP, PEDF и RPE65; отображает классический высоко пигментированные гексагональную НПП морфологию; и выполняет RPE функции, такие как фагоцитоз, ретиноидов обработки и секреции 11 – цис-ретиналь 5,16. Однако, прежде чем IPS-НПП может использоваться в терапевтических целях, IPS-НПП должны быть тщательно описаны. Понимание факторов, которые регулируют НПП дифференциацию необходимо улучшить выход и чистоту клеток, который будет использоваться для клинических применений.
Дифференциация Cell является результатом высокой регулируемой экспрессии генов. Эпигенетическая реконструкция генома и координации транскрипционных факторов, необходимых для клеточных судеб решений, которые происходят во время дифференцировки и развития 17. Регулирование сообщения РНК (мРНК) перевод на микроРНК (микроРНК) представляет еще один уровень регулирования, который влияет клеток судьбу 1. MiRNAs короткие, ~ 22 нт, длины нуклеотидов, которые либо подавляют переводсвязывание с 3 'UTR мРНК или целевой мРНК деградации. MiRNAs были обнаружены практически во всех тканях и на сегодняшний день более 2000 уникальных человека микроРНК были зарегистрированы в базе данных miRBase. С микроРНК требуют только частичное взаимодополняемости для привязки к мРНК-мишени, одна микроРНК может потенциально связываются с десятков или сотен целей, и наоборот, т.е. один мРНК могут быть направлены на несколько различных микроРНК. Это беспорядочный связывания характерно резко повышает уровень сложности регулирования, а также уровень сложности определения функций отдельных микроРНК и роль каждый из них играет в клеточных функций 18-21. Тем не менее, исследования показали, что микроРНК уточняет экспрессию генов в процессе дифференцировки, влияя статус метилирования ДНК 17. В исследовании, более конкретной, чтобы ПЭС, miR-204/211 было показано, чтобы способствовать эпителиальный фенотип ПЭС 22. Другая группа проанализировала профиля микроРНКНПП во время дифференцировки из ЭС клеток и показали различные наборы микроРНК экспрессируются в процессе дифференцировки 23. На самом деле, профили микроРНК можно однозначно отличить типы клеток, в том числе ЭС клеток, клеток-предшественников, и терминально дифференцированных клеток 24,25. Более 250 микроРНК экспрессируются в сетчатке. На основе этих исследований, мы предполагаем, что микроРНК играют важную роль в дифференциации ПЭС от IPS.
Цель данного доклада является описание протоколов для дифференциации ПЭС от IMR90-4 IPS клетки, коллекция РНК для анализа микрочипов, а также анализ данных микрочипов для выявления микроРНК, которые разному экспрессируются среди трех типов клеток, иПСК , IPS-НПП и плода НПП. Суммарную РНК экстрагировали из культур каждого типа клеток и гибридизовали с микрочипов микроРНК, содержащий зонды, специфичные для человека микроРНК 1205 и 144 вирусных микроРНК. Результаты микрочипов были сравнитьD, чтобы определить, которые были дифференциально экспрессируются микроРНК среди различных типов клеток. были выбраны микроРНК с 2 раза или более кратное изменение в выражении для дальнейшего анализа. Программа, анализ микроРНК был использован для выявления потенциальных целей в дифференциально выраженных микроРНК и генерировать сотовых сетей регулируются выбранных микроРНК.
Protocol
Representative Results
Discussion
В заключение, этот доклад описывает методы, используемые для культивирования плюрипотентных клеток, IPS-РПЭ и плода НПП. НПП происходит от IPS морфологически и функционально похож на плода РПЭ. IPS-НПП также выражает характерные гены РПЭ включая RPE65, CRALBP, PEDF и ТАПБР 16. Для дальнейшего х?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мнения или утверждения, содержащиеся здесь, являются частные взгляды авторов и не должны быть истолкованы в качестве официальной или в качестве точки зрения Департамента армии или министерства обороны.
Это исследование было проведено в то время как авторы Уитни А. Грин, Альберто Мунис, и Рамеш Р. Kaini провел Национальный исследовательский совет докторской научный Associateship на USAISR.
Microarray анализы проводили по Greehey Детской научно-исследовательский институт рака микрочипов основной комплекс и биоинформатика Департамента в UT Health Science Center Сан-Антонио.
Эта работа была поддержана армии США программы Клиническая восстановительная медицина исследований (CRMRP) и военной программе Оперативный медицины Научно-исследовательский (MOMRP).
Materials
| mTeSR1 media + 5X supplement | Stem Cell Technologies | 5850 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M-7154 | |
| Non essential amino acids | Hyclone(Fisher) | SH30853.01 | |
| Knockout serum replacement | Life Technologies | 10828-028 | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | |
| MEM media | Life Technologies | 10370-021 | |
| N1 supplement | Sigma | N-6530-5ML | |
| Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888-1G | |
| Fetal bovine serum | Hyclone(Fisher) | SH3008803HI | |
| Triiodo-l-thyronine sodium salt | Sigma | T6397 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881 | |
| Fetal RPE media RTEGM kit | Life Technologies | 195406 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| Phosphate buffered saline | Hyclone(Fisher) | 10010-023 | |
| Trypsin | Hyclone(Fisher) | 25200-072 | |
| Miltenyi Biotec washing buffer | StemGent | 130-092-987 | |
| Miltenyi Biotec rinsing buffer | StemGent | 130-092-222 | |
| Anti-TRA-1-60 microbead kit | StemGent | 130-095-816 | |
| Miltenyi Biotec cell sorter column | StemGent | 130-021-101 | |
| RNeasy micro kit | Qiagen | 74004 | |
| QIA shredder | Qiagen | 79654 | |
| RNA 6000 Pico LabChip kit | Agilent | G2938-90046 | |
| Human miRNA microarray v16 | Agilent | G4471A |
Referências
- Yu, Z., et al. miRNAs regulate stem cell self-renewal and differentiation. Front Genet. 3, 191 (2012).
- Romano, G., et al. A commentary on iPS cell biology: Potential applications in autologous tissue and cell transplantation, development of new models for the study of human pathological conditions and drug screening. J Cell Physiol. 229, 148-152 (2014).
- Almeida, P. E., et al. Immunogenicity of pluripotent stem cells and their derivatives. Circ Res. 112, 549-561 (2013).
- Buchholz, D. E., et al. Derivation of functional retinal pigmented epithelium from induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27, 2427-2434 (2009).
- Kokkinaki, M., et al. Human induced pluripotent stem-derived retinal pigment epithelium (RPE) cells exhibit ion transport, membrane potential, polarized vascular endothelial growth factor secretion, and gene expression pattern similar to native RPE. Stem Cells. 29, 825-835 (2011).
- Bharti, K., et al. The new paradigm: retinal pigment epithelium cells generated from embryonic or induced pluripotent stem cells. Pigment Cell Melanoma Res. 24, 21-34 (2011).
- Park, I. H., et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451, 141-146 (2008).
- Pera, M. F. Stem cells. A new year and a new era. Nature. 451, 135-136 (2008).
- Subba Rao, M., et al. Thinking outside the liver: Induced pluripotent stem cells for hepatic applications. World J Gastroenterol. 19, 3385-3396 (2013).
- Yoshida, Y., Yamanaka, S. iPS cells: a source of cardiac regeneration. J Mol Cell Cardiol. 50, 327-332 (2011).
- Lee, K. S., et al. Human sensory neurons derived from induced pluripotent stem cells support varicella-zoster virus infection. PLoS One. 7, (2012).
- Alipio, Z., et al. Reversal of hyperglycemia in diabetic mouse models using induced-pluripotent stem (iPS)-derived pancreatic beta-like cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 13426-13431 (2010).
- la Cour, M., Tezel, T. The retinal pigment epithelium. Adv Organ Biol. 10, 253-272 (2005).
- Carr, A. J., et al. Protective effects of human iPS-derived retinal pigment epithelium cell transplantation in the retinal dystrophic rat. PLoS One. 4, (2009).
- Schwartz, S. D., et al. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. Lancet. 379, 713-720 (2012).
- Muniz, A., et al. Retinoid uptake, processing and secretion in human iPS-RPE support the visual cycle. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, 198-209 (2014).
- Leonardo, T. R., et al. The functions of microRNAs in pluripotency and reprogramming. Nat Cell Biol. 14, 1114-1121 (2012).
- Arora, A., et al. Prediction of microRNAs affecting mRNA expression during retinal development. BMC Dev Biol. 10, (2010).
- Huntzinger, E., Izaurralde, E. Gene silencing by microRNAs: contributions of translational repression and mRNA decay. Nat Rev Genet. 12, 99-110 (2011).
- Mallanna, S. K., Rizzino, A. Emerging roles of microRNAs in the control of embryonic stem cells and the generation of induced pluripotent stem cells. Dev Biol. 344, 16-25 (2010).
- Guo, H., et al. Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels. Nature. 466, 835-840 (2010).
- Adijanto, J., et al. Microphthalmia-associated transcription factor (MITF) promotes differentiation of human retinal pigment epithelium (RPE) by regulating microRNAs-204/211 expression. J Biol Chem. 287, 20491-20503 (2012).
- Hu, G., et al. Identification of miRNA signatures during the differentiation of hESCs into retinal pigment epithelial cells. PLoS One. 7, (2012).
- Wilson, K. D., et al. MicroRNA profiling of human-induced pluripotent stem cells. Stem Cells Dev. 18, 749-758 (2009).
- Neveu, P., et al. MicroRNA profiling reveals two distinct p53-related human pluripotent stem cell states. Cell Stem Cell. 7, 671-681 (2010).
- Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, 3612-3624 (2006).
- Qiagen, miRNeasy Mini Handbook. Sample and Assay Technologies. , (2013).
- . Microarray System with miRNA Complete Labeling and Hyb Kit. Agilent Technologies. , (2011).
- . Maintenance of hESCs and hiPSCs in mTESR1 and mTESR2. Stem Cell Technologies. , (2010).
- . The Analysis of DNA or RNA using its wavelengths: 230 nm, 260 nm, 280 nm. About Biotechnology. , (2013).
