MikroRNA Expression Profiler av Human iPS-celler, pigmentepitelet härledas från iPS, och Fetal pigmentepitelet
Summary
Den mikroRNA (miRNA) profiler av mänskligt framkallade-pluripotenta stamceller (iPS-celler), retinal pigment epitel (RPE) som härrör från humant framkallade-pluripotenta stamceller (iPS) celler (iPS-RPE), och foster RPE, jämfördes.
Abstract
Syftet med denna rapport är att beskriva protokoll för att jämföra mikroRNA (miRNA) profiler av mänskligt framkallade-pluripotenta stamceller (iPS) celler, retinal pigment epitel (RPE) som härrör från mänskliga iPS-celler (iPS-RPE), och foster RPE. Protokollen omfattar insamling av RNA för analys av microarray, och analys av microarraydata för att identifiera miRNA som differentiellt uttrycks bland tre celltyper. Metoderna för odling av iPS-celler och fetala RPE förklaras. Det protokoll som används för differentiering av RPE från human iPS beskrivs också. RNA-extraktion teknik beskriver vi valdes för att möjliggöra maximal återvinning av mycket små RNA för användning i en miRNA microarray. Slutligen cell-bana och nätverksanalys av microarray uppgifter förklaras. Dessa tekniker kommer att underlätta jämförelsen av miRNA profiler av tre olika celltyper.
Introduction
Stamceller har förmåga att replikera obegränsat och kan differentieras till någon somatisk celltyp. Utvecklingen av tekniker för att programmera om somatiska celler till pluripotenta stamceller har framkallat stor uppståndelse i forskarsamhället och bland läkare, som tillkomsten av personliga vävnadsregenerering är på horisonten 1. Induced-pluripotenta stamceller (iPS) celler uppvisar samma funktioner i obegränsade replika potential och pluripotens som embryonala stamceller (ES-celler) samtidigt som den kringgår de etiska dilemman i samband med ekonomiska och sociala råd. Dessutom kommer patientgenererade stamceller inte stimulera ett immunsvar, kraftigt ökar sannolikheten för framgångsrika terapeutiska tillämpningar 2-3. Under vissa odlingsbetingelser, har iPS-celler visat att differentiera till flera olika celltyper in vitro, inklusive cardiomyocytes, neuroner, betacellerna i bukspottkörteln, leverceller och retinal pigmenterade epitel (RPE) 4-12.
RPE är en specialiserad skikt av pigmenterade epitelceller belägna på baksidan av näthinnan som har flera funktioner som är väsentliga för visuella hälsa och funktion, såsom absorption av ströljus, fagocytos av fotoreceptoryttersegmenten, och bearbetning av retinoider för produktion av visuell kromoforen. Dysfunktion i RPE grund av skada eller sjukdom djupt påverkar ljusmätare hälsa och visuell funktion som framgår av de bländande sjukdomar som är en följd av underliggande RPE patologi såsom åldersrelaterad makuladegeneration (AMD), Stargardts sjukdom, och retinitis pigmentosa (RP) 13. Verkligen effektiva behandlingar som kan återställa synen har inte uppnåtts, och ersättning av sjuka RPE med friska RPE kan vara det bästa alternativet för att förhindra synförlust 14-15. RPE härrör från iPS (iPS-RPE) är en möjlig källa till celler för att ersätta den skadade RPE. iPS-RPE uttrycker karakteristiskatic RPE proteiner LRAT, CRALBP, PEDF och RPE65; visar den klassiska högt pigmente sexkantiga RPE morfologi; och utför RPE funktioner såsom fagocytos, retinoida bearbetning och utsöndring av 11 – cis retinal 5,16. Men innan iPS-RPE kan användas terapeutiskt, iPS-RPE måste noggrant karakteriserats. Att förstå de faktorer som styr RPE differentiering är nödvändig för att förbättra utbytet och renheten av de celler som skall användas för kliniska tillämpningar.
Celldifferentiering är ett resultat av mycket reglerad genexpression. Epigenetisk ombyggnad av genomet och samordning av transkriptionsfaktorer som krävs för cell öde beslut som inträffar under differentiering och utveckling 17. Reglering av meddelande-RNA (mRNA) översättning av mikro-RNA (miRNA) presenterar ännu en nivå av reglering som påverkar cellens öde 1. MiRNA är korta, ~ 22 nt, längder av nukleotider som antingen undertrycka översättningbindning till 3'-UTR av mRNA eller rikta mRNA för nedbrytning. MiRNA har upptäckts i praktiskt taget alla vävnader och hittills över 2.000 unika mänskliga mikroRNA har registrerats i miRBase databasen. Eftersom miRNA kräver endast delvis kompletterar varandra för att binda till mål-mRNA, kan en enda miRNA potentiellt binder till tiotals eller hundratals mål, och vice versa, dvs en enda mRNA kan riktas genom flera olika miRNA. Denna promiskuösa bindande kännetecken ökar dramatiskt graden av komplexitet reglering samt graden av svårigheten att bestämma funktionerna hos enskilda miRNA och vilken roll var och en spelar i cellulära funktioner 18-21. Trots detta har studier visat att miRNA förädlar genuttryck under differentiering genom att påverka DNA-metylering status 17. I en studie mer specifika för RPE ades miR-204/211 visats främja epitelial fenotyp i RPE 22. En annan grupp analyserade miRNA profilav RPE under differentiering av ES-celler och visade distinkta uppsättningar av miRNA uttrycks under differentieringsprocessen 23. I själva verket kan miRNA profiler entydigt särskilja celltyper, inklusive ES-celler, föregångarceller och terminalt differentierade celler 24,25. Över 250 miRNAs uttrycks i näthinnan. Baserat på dessa studier, hypotes vi att miRNA spelar en viktig roll vid differentieringen av RPE från Ips.
Syftet med denna rapport är att beskriva protokollen för differentiering av RPE från IMR90-4 iPS-celler, insamling av RNA för analys av microarray, och analys av microarraydata för att identifiera miRNA som differentiellt uttrycks bland tre celltyper, iPS-celler , iPS-RPE och foster RPE. Totalt RNA extraherades från odlingar av varje celltyp och hybridiserades till en miRNA microarray, som innehåller sönder specifika för 1205 mänskliga miRNA och 144 virala miRNA. De microarray Resultaten jämförad för att avgöra vilka miRNA var differentiellt uttryckta mellan de olika celltyper. miRNA med 2-faldig eller större faldig förändring i expression valdes ut för vidare analys. En miRNA analysprogram program användes för att identifiera potentiella mål för differentiellt uttryckta miRNA och generera mobilnät regleras av de utvalda miRNA.
Protocol
Representative Results
Discussion
Avslutningsvis beskrivs i rapporten de metoder som används för kultur iPS-celler, iPS-RPE och foster RPE. RPE härrör från iPS är morfologiskt och funktionellt liknar foster RPE. IPS-RPE uttrycker också karakteristiska RPE gener inklusive RPE65, CRALBP, PEDF och LRAT 16. För att ytterligare karaktärisera dessa celler extraherades RNA och användes för att utföra mikromatrisanalys för att identifiera differentiellt uttryckta miRNA. Analys av signalintensiteterna visade att det största antalet diffe…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yttrandena eller påståenden i detta dokument är de privata åsikter författarnas och ska inte tolkas som tjänsteman eller som avspeglar synpunkter från avdelningen av armén eller försvarsdepartementet.
Denna forskning utfördes medan författarna Whitney A. Greene, Alberto Muniz, och Ramesh R. Kaini höll en National Research Council Forskarassistent Associateship på USAISR.
Microarray analyser utfördes av Greehey Barnens Cancer Research Institute Microarray Core Facility och bioinformatik Institutionen vid UT Health Science Center i San Antonio.
Detta arbete stöddes av amerikanska armén klinisk rehabiliterings Medicine Research Program (CRMRP) och Militära Operational Medicine Research Program (MOMRP).
Materials
| mTeSR1 media + 5X supplement | Stem Cell Technologies | 5850 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M-7154 | |
| Non essential amino acids | Hyclone(Fisher) | SH30853.01 | |
| Knockout serum replacement | Life Technologies | 10828-028 | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | |
| MEM media | Life Technologies | 10370-021 | |
| N1 supplement | Sigma | N-6530-5ML | |
| Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888-1G | |
| Fetal bovine serum | Hyclone(Fisher) | SH3008803HI | |
| Triiodo-l-thyronine sodium salt | Sigma | T6397 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881 | |
| Fetal RPE media RTEGM kit | Life Technologies | 195406 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| Phosphate buffered saline | Hyclone(Fisher) | 10010-023 | |
| Trypsin | Hyclone(Fisher) | 25200-072 | |
| Miltenyi Biotec washing buffer | StemGent | 130-092-987 | |
| Miltenyi Biotec rinsing buffer | StemGent | 130-092-222 | |
| Anti-TRA-1-60 microbead kit | StemGent | 130-095-816 | |
| Miltenyi Biotec cell sorter column | StemGent | 130-021-101 | |
| RNeasy micro kit | Qiagen | 74004 | |
| QIA shredder | Qiagen | 79654 | |
| RNA 6000 Pico LabChip kit | Agilent | G2938-90046 | |
| Human miRNA microarray v16 | Agilent | G4471A |
Referências
- Yu, Z., et al. miRNAs regulate stem cell self-renewal and differentiation. Front Genet. 3, 191 (2012).
- Romano, G., et al. A commentary on iPS cell biology: Potential applications in autologous tissue and cell transplantation, development of new models for the study of human pathological conditions and drug screening. J Cell Physiol. 229, 148-152 (2014).
- Almeida, P. E., et al. Immunogenicity of pluripotent stem cells and their derivatives. Circ Res. 112, 549-561 (2013).
- Buchholz, D. E., et al. Derivation of functional retinal pigmented epithelium from induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27, 2427-2434 (2009).
- Kokkinaki, M., et al. Human induced pluripotent stem-derived retinal pigment epithelium (RPE) cells exhibit ion transport, membrane potential, polarized vascular endothelial growth factor secretion, and gene expression pattern similar to native RPE. Stem Cells. 29, 825-835 (2011).
- Bharti, K., et al. The new paradigm: retinal pigment epithelium cells generated from embryonic or induced pluripotent stem cells. Pigment Cell Melanoma Res. 24, 21-34 (2011).
- Park, I. H., et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451, 141-146 (2008).
- Pera, M. F. Stem cells. A new year and a new era. Nature. 451, 135-136 (2008).
- Subba Rao, M., et al. Thinking outside the liver: Induced pluripotent stem cells for hepatic applications. World J Gastroenterol. 19, 3385-3396 (2013).
- Yoshida, Y., Yamanaka, S. iPS cells: a source of cardiac regeneration. J Mol Cell Cardiol. 50, 327-332 (2011).
- Lee, K. S., et al. Human sensory neurons derived from induced pluripotent stem cells support varicella-zoster virus infection. PLoS One. 7, (2012).
- Alipio, Z., et al. Reversal of hyperglycemia in diabetic mouse models using induced-pluripotent stem (iPS)-derived pancreatic beta-like cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 13426-13431 (2010).
- la Cour, M., Tezel, T. The retinal pigment epithelium. Adv Organ Biol. 10, 253-272 (2005).
- Carr, A. J., et al. Protective effects of human iPS-derived retinal pigment epithelium cell transplantation in the retinal dystrophic rat. PLoS One. 4, (2009).
- Schwartz, S. D., et al. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. Lancet. 379, 713-720 (2012).
- Muniz, A., et al. Retinoid uptake, processing and secretion in human iPS-RPE support the visual cycle. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, 198-209 (2014).
- Leonardo, T. R., et al. The functions of microRNAs in pluripotency and reprogramming. Nat Cell Biol. 14, 1114-1121 (2012).
- Arora, A., et al. Prediction of microRNAs affecting mRNA expression during retinal development. BMC Dev Biol. 10, (2010).
- Huntzinger, E., Izaurralde, E. Gene silencing by microRNAs: contributions of translational repression and mRNA decay. Nat Rev Genet. 12, 99-110 (2011).
- Mallanna, S. K., Rizzino, A. Emerging roles of microRNAs in the control of embryonic stem cells and the generation of induced pluripotent stem cells. Dev Biol. 344, 16-25 (2010).
- Guo, H., et al. Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels. Nature. 466, 835-840 (2010).
- Adijanto, J., et al. Microphthalmia-associated transcription factor (MITF) promotes differentiation of human retinal pigment epithelium (RPE) by regulating microRNAs-204/211 expression. J Biol Chem. 287, 20491-20503 (2012).
- Hu, G., et al. Identification of miRNA signatures during the differentiation of hESCs into retinal pigment epithelial cells. PLoS One. 7, (2012).
- Wilson, K. D., et al. MicroRNA profiling of human-induced pluripotent stem cells. Stem Cells Dev. 18, 749-758 (2009).
- Neveu, P., et al. MicroRNA profiling reveals two distinct p53-related human pluripotent stem cell states. Cell Stem Cell. 7, 671-681 (2010).
- Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, 3612-3624 (2006).
- Qiagen, miRNeasy Mini Handbook. Sample and Assay Technologies. , (2013).
- . Microarray System with miRNA Complete Labeling and Hyb Kit. Agilent Technologies. , (2011).
- . Maintenance of hESCs and hiPSCs in mTESR1 and mTESR2. Stem Cell Technologies. , (2010).
- . The Analysis of DNA or RNA using its wavelengths: 230 nm, 260 nm, 280 nm. About Biotechnology. , (2013).
