MikroRNA uttrykk profiler av menneskelige iPS celler, retinal pigment epitelet avledet fra iPS, og Fetal Netthinne Pigment Epitel

Summary

Den mikroRNA (miRNA) profiler av menneskeskapte-pluripotent stem (iPS) celler, retinal pigment epitel (RPE) stammer fra menneskeskapte-pluripotent stem (iPS-celler) (iPS-RPE), og foster RPE, ble sammenlignet.

Abstract

Målet med denne rapporten er å beskrive protokollene for å sammenligne mikroRNA (miRNA) profiler av menneskeskapte-pluripotent stem (iPS-celler), retinal pigment epitel (RPE) utledet fra menneskelige iPS-celler (iPS-RPE), og foster RPE. Protokollene omfatter innsamling av RNA for analyse ved microarray, og analyse av mikroarray data for å identifisere miRNAs som er differensielt uttrykt blant tre celletyper. Metodene for kultur iPS-celler og foster RPE er forklart. Protokollen som brukes for differensiering av RPE fra menneskelige iPS er også beskrevet. Den RNA ekstraksjon teknikk vi beskriver ble valgt for å tillate maksimal gjenvinning av svært små RNA for bruk i en miRNA microarray. Til slutt blir cellemessige og nettverksanalyse av microarray data forklart. Disse teknikkene vil lette sammenligning av de miRNA profiler av tre forskjellige celletyper.

Introduction

Stamceller har kapasitet til å replikere uten grense, og potensialet til å differensiere til alle somatiske celletype. Utvikling av teknikker for å omprogrammere somatiske celler i pluripotent stamceller, har medført stor spenning i forskersamfunnet og blant klinikere, som bruk av personlig vev gjenfødelse er på horisonten ^en. Indusert-pluripotent stamceller (iPS-celler) viser samme funksjonene i ubegrenset replicative potensial og pluripotency som embryonale stamceller (ES-celler) mens omgå de etiske dilemmaer knyttet til ESCs. I tillegg vil pasient-avledet stamceller ikke stimulerer en immunrespons, i stor grad øke sannsynligheten for vellykket terapeutiske anvendelser ^2-3. Under bestemte kultur vilkår, har iPS-celler er vist å differensiere i flere ulike celletyper in vitro, inkludert cardiomyocytes, nerveceller, betaceller i bukspyttkjertelen, leverceller, og retinal pigmentert epitel (RPE) ^4-12.

Den RPE er en spesialisert lag av pigmenterte epitel-celler lokalisert på baksiden av retina som utfører flere funksjoner som er avgjørende for visuell helse og funksjon, for eksempel absorpsjon av strølys, fagocytose av fotoreseptoren ytre segmenter, og behandling av retinoider for produksjonen av visuell chromophore. Dysfunksjon av RPE på grunn av skade eller sykdom dypt påvirker fotoreseptoren helse og visuell funksjon som gjenspeiles av de blindende sykdommer som er et resultat av underliggende RPE patologi som aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD), Stargardts sykdom, og retinitis pigmentosa (RP) ^13. Virkelig effektive behandlinger som kan gjenopprette synet har ikke blitt oppnådd, og utskifting av sykelig RPE med sunn RPE kan være det beste alternativet for å hindre tap av syn ^14-15. RPE avledet fra iPS (iPS-RPE) er en mulig kilde til celler for å erstatte den skadede RPE. iPS-RPE uttrykker kjennetegntic RPE proteiner LRAT, CRALBP, PEDF, og RPE65; viser den klassiske svært pigmentert sekskantede RPE morfologi; og utfører RPE funksjoner som fagocytose, retinoid prosessering og sekresjon av 11 – cis-retinal ^5,16. Men før IPS-RPE kan benyttes terapeutisk, er IPS-RPE må være grundig karakterisert. Å forstå de faktorer som styrer RPE differensiering er nødvendig for å forbedre utbyttet og renheten av de celler som skal brukes for kliniske formål.

Celledifferensiering er et resultat av svært regulert genekspresjon. Epigenetisk ombygging av genomet og koordinering av transkripsjonsfaktorer er nødvendig for celle skjebne beslutninger som oppstår under differensiering og utvikling ^17. Regulering av melding RNA (mRNA) oversettelse av mikroRNA (miRNA) presenterer enda et nivå for regulering som påvirker celle skjebne ^en. MiRNAs er korte, ~ 22 nt, lengder av nukleotider som enten undertrykke oversettelse avbinding til 3 'UTR av mRNA eller mål-mRNA for nedbrytning. MiRNAs er påvist i nesten alle vev og til dags dato har over 2000 unike menneskelige microRNAs har blitt registrert i miRBase database. Siden mirnas krever bare delvis komplementaritet å binde seg til målet mRNA, kan en enkelt miRNA potensielt binde seg til flere titalls eller hundrevis av mål, og vice versa, dvs. en enkelt mRNA kan bli målrettet av flere forskjellige miRNAs. Dette promiskuøs bindende karakteristisk dramatisk øker nivået av kompleksitet regulering samt vanskelighetsgraden av å bestemme funksjonene til individuelle mirnas og rollen hver spiller i cellulære funksjoner ^18-21. Likevel, har studier vist at miRNA foredler genuttrykk under differensiering ved å påvirke DNA metylering status ^17. I en studie mer spesifikke for RPE, ble miR-204/211 vist seg å fremme epitelial fenotype av RPE ^22. En annen gruppe analyserte miRNA profilav RPE under differensiering fra ES-celler og avslørte distinkt sett av miRNA er uttrykt i løpet av differensiering prosessen ^23. Faktisk kan miRNA profiler entydig skille celletyper, inkludert ES-celler, forløper celler og terminalt differensierte celler ^24,25. Over 250 mirnas er uttrykt i netthinnen. Basert på disse studiene, hypotese vi at miRNAs spiller en viktig rolle under differensiering av RPE fra iPS.

Målet med denne rapporten er å beskrive protokollene for differensiering av RPE fra IMR90-4 iPS-celler, samling av RNA for analyse av microarray, og analyse av microarray data for å identifisere mirnas som er forskjellig uttrykt mellom tre celletyper, iPS-celler , iPS-RPE og foster RPE. Total RNA ble hentet fra kulturer av hver celletype og hybridisert til en miRNA microarray, som inneholder prober spesifikke for 1205 menneskelige miRNAs og 144 viral miRNAs. Mikromatriser resultater ble sammenligned for å finne ut hvilke mirnas var forskjellig uttrykt mellom de ulike celletyper. miRNAs med 2 ganger eller mer ganger endring i ekspresjon ble valgt ut for videre analyse. En miRNA analyse program ble brukt til å identifisere potensielle mål av forskjellig uttrykt mirnas og å generere mobilnettverk som reguleres av de valgte mirnas.

Protocol

En. Utarbeidelse av kultur reagenser og kultur plater mTeSR1 media: Forbered mTeSR1 media i henhold til produsentens anvisninger. Tine 100 ml mTeSR1 5x supplement natten ved 4 ° C. Tilsett 100 ml mTeSR1 5x supplement til 400 ml mTeSR1 basale media og bland godt. Dette mediet er stabile ved 4 ° C i opp til 2 uker, og ved -20 ° C i 6 måneder. Differensiering middel: Tilbered differensiering medier i DMEM/F12, hvorved 0,1 mM β-mercaptoethanol, 0,1 mM ikke-essensielle aminosyrer, 2,0 mM L-glutamin,…

Representative Results

iPS-celler (Figur 1a) ble dyrket i differensiering forhold for å indusere differensiering i iPS-RPE celler. Den iPS-RPE utstilt klassiske RPE fenotype av sekskantede pigmentert cellemorfologi (Figur 1B) ligner på foster RPE (figur 1C). For bedre å forstå den rollen som miRNA kan spille i løpet av prosessen med differensiering fra iPS til iPS-RPE, ble utført microarray analyse av miRNA uttrykk. Total RNA ble samlet inn fra iPS-celler, f…

Discussion

I konklusjonen, beskriver denne rapporten metodene som brukes til kultur iPS-celler, iPS-RPE og foster RPE. RPE avledet fra iPS er morfologisk og funksjonelt lik foster RPE. Den iPS-RPE uttrykker også karakteristiske RPE gener inkludert RPE65, CRALBP, PEDF, og LRAT ^16. For ytterligere å karakterisere disse cellene, ble RNA ekstrahert og brukt til å utføre mikromatriseanalyse for å identifisere differensielt uttrykt miRNA. Analyse av signal intensiteter avslørte at flest forskjellig uttrykt miRNAs ble op…

Materials

mTeSR1 media + 5X supplement	Stem Cell Technologies	5850
DMEM/F12	Life Technologies	11330-032
2-Mercaptoethanol	Sigma	M-7154
Non essential amino acids	Hyclone(Fisher)	SH30853.01
Knockout serum replacement	Life Technologies	10828-028
Gentamicin	Life Technologies	15750-060
MEM media	Life Technologies	10370-021
N1 supplement	Sigma	N-6530-5ML
Taurine	Sigma	T-8691-25G
Hydrocortisone	Sigma	H0888-1G
Fetal bovine serum	Hyclone(Fisher)	SH3008803HI
Triiodo-l-thyronine sodium salt	Sigma	T6397
Sodium hydroxide	Sigma	S5881
Fetal RPE media RTEGM kit	Life Technologies	195406
Dispase	Life Technologies	17105-041
Matrigel	BD Biosciences	354277
Phosphate buffered saline	Hyclone(Fisher)	10010-023
Trypsin	Hyclone(Fisher)	25200-072
Miltenyi Biotec washing buffer	StemGent	130-092-987
Miltenyi Biotec rinsing buffer	StemGent	130-092-222
Anti-TRA-1-60 microbead kit	StemGent	130-095-816
Miltenyi Biotec cell sorter column	StemGent	130-021-101
RNeasy micro kit	Qiagen	74004
QIA shredder	Qiagen	79654
RNA 6000 Pico LabChip kit	Agilent	G2938-90046
Human miRNA microarray v16	Agilent	G4471A