Perfiles de expresión de microARN de las células iPS humanas, de la retina del epitelio pigmentario Derivado de Ips y Fetal epitelio pigmentario de la retina
Summary
El perfil de madre humanas pluripotentes inducidas (iPS), el epitelio pigmentario de la retina (RPE) derivadas de células (iPS) (iPS-RPE) inducido por el hombre-madre pluripotentes, y RPE fetal microRNA (miRNA), fueron comparados.
Abstract
El objetivo de este informe es describir los protocolos para la comparación de los perfiles de las células (iPS), el epitelio pigmentario de la retina (EPR) inducido por el hombre-pluripotentes madre derivadas de células iPS humanas (iPS-RPE), y RPE fetal microRNA (miRNA). Los protocolos incluyen la entrega de ARN para el análisis de microarrays y el análisis de datos de microarrays para identificar miRNAs que son expresados diferencialmente entre los tres tipos de células. Se explican los métodos de cultivo de células iPS y RPE fetal. El protocolo utilizado para la diferenciación de RPE de iPS humanas también se describe. La técnica de extracción de ARN se describe fue seleccionada para permitir la recuperación máxima de muy pequeño ARN para su uso en un microarray de miARN. Por último, se explica vía celular y el análisis de redes de datos de microarrays. Estas técnicas facilitar la comparación de los perfiles de miARN de tres tipos de células diferentes.
Introduction
Las células madre tienen la capacidad de replicarse sin límite y el potencial de diferenciarse en cualquier tipo de célula somática. El desarrollo de técnicas para reprogramar células somáticas en células madre pluripotentes ha despertado gran expectación en la comunidad científica y entre los médicos, ya que el advenimiento de la regeneración del tejido personalizado está en el horizonte 1. Las células madre pluripotentes inducidas por el (iPS) presentan las mismas características del potencial de replicación ilimitado y pluripotencia como las células madre embrionarias (ES) eludiendo los dilemas éticos asociados con los CES. Además, las células madre derivadas de paciente no estimular una respuesta inmune, incrementando en gran medida la probabilidad de aplicaciones terapéuticas exitosas 2-3. Bajo condiciones de cultivo específicas, las células iPS se ha demostrado que se diferencian en varios tipos de células diferentes in vitro, incluyendo los cardiomiocitos, neuronas, células beta pancreáticas, hepatocitos, y en el epitelio pigmentario de la retina (RPE) 4-12.
El RPE es una capa especializada de células epiteliales pigmentadas situados en la parte posterior de la retina que realiza varias funciones que son esenciales para la salud visual y función tal como la absorción de luz parásita, la fagocitosis de los segmentos externos de los fotorreceptores, y el procesamiento de los retinoides para la producción de cromóforo visual. La disfunción del EPR debido al daño o la enfermedad afecta profundamente la salud de los fotorreceptores y la función visual como lo demuestran las enfermedades que causan ceguera que son el resultado de la patología EPR subyacente, como la degeneración macular senil (AMD), la enfermedad de Stargardt y la retinitis pigmentosa (RP) 13. Tratamientos verdaderamente eficaces que pueden restaurar la visión no se han alcanzado, y la sustitución de RPE enferma con RPE saludable puede ser la mejor opción para evitar la pérdida de la visión 14-15. RPE derivadas de iPS (IPS-RPE) es una posible fuente de células para reemplazar el EPR dañado. iPS-RPE expresa caracproteínas RPE tic LRAT, CRALBP, PEDF y RPE65; muestra la alta pigmentación morfología RPE hexagonal clásica; y lleva a cabo las funciones del EPR como la fagocitosis, procesamiento de retinoides, y la secreción de 11 – 5,16 retinal cis. Sin embargo, antes iPS-RPE puede ser utilizado terapéuticamente, el IPS-RPE se debe caracterizar a fondo. La comprensión de los factores que gobiernan la diferenciación de RPE es necesario mejorar el rendimiento y la pureza de las células para ser utilizado para aplicaciones clínicas.
La diferenciación celular es el resultado de la expresión génica altamente regulado. Remodelación epigenética del genoma y la coordinación de factores de transcripción se requiere para las decisiones del destino celular que se producen durante la diferenciación y el desarrollo 17. Reglamento de ARN mensajero (ARNm) Traducción por microRNA (miRNA) presenta otro nivel de regulación que afecta el destino celular 1. MiRNAs son cortos, ~ 22 nt, longitudes de nucleótidos que, o bien la traducción de supresión porla unión a la 3 'UTR del ARNm diana o el ARNm de la degradación. MiRNAs se han detectado en prácticamente todos los tejidos y hasta la fecha más de 2.000 microARNs humanos únicos se han registrado en la base de datos miRBase. Desde miRNAs requieren complementariedad parcial para unirse al ARNm diana, un solo miARN potencialmente puede obligar a decenas o cientos de objetivos, y viceversa, es decir, un único mRNA puede ser objetivo de varios miRNAs diferentes. Esta característica de unión promiscua aumenta dramáticamente el nivel de complejidad de la regulación, así como el nivel de dificultad de determinar las funciones de miRNAs individuales y el papel que desempeña cada uno en las funciones celulares 18-21. Sin embargo, los estudios han demostrado que los miRNA refina la expresión génica durante la diferenciación, al afectar el estado de metilación del ADN 17. En un estudio más específico de la RPE, miR-204/211 ha demostrado promover el fenotipo epitelial de la RPE 22. Otro grupo analizó el perfil de miARNde RPE durante la diferenciación de células madre embrionarias y reveló distintos conjuntos de miRNA se expresan durante el proceso de diferenciación 23. De hecho, los perfiles de miARN sin ambigüedades pueden distinguir tipos de células, incluyendo células madre embrionarias, células precursoras, y células diferenciadas terminalmente 24,25. Más de 250 miRNAs se expresan en la retina. Sobre la base de estos estudios, la hipótesis de que los miRNAs juegan un papel importante durante la diferenciación de RPE de iPS.
El objetivo de este informe es describir los protocolos para la diferenciación de RPE de IMR90-4 células iPS, colección de ARN para el análisis de microarrays y el análisis de datos de microarrays para identificar miRNAs que son expresados diferencialmente entre los tres tipos de células, las células iPS , iPS-EPR y EPR fetal. El ARN total se extrajo a partir de cultivos de cada tipo de célula y se hibridó a un microarray miARN, que contiene sondas específicas para 1205 miRNAs humanos y 144 miRNAs virales. Los resultados de microarrays se comparand para determinar qué miRNAs fueron expresados diferencialmente entre los diferentes tipos de células. miRNAs con 2 veces o más veces el cambio en la expresión fueron seleccionados para su posterior análisis. Un programa de software de análisis de miRNA se utilizó para identificar los posibles objetivos de los miRNAs expresados diferencialmente y generar redes celulares reguladas por los miRNAs seleccionados.
Protocol
Representative Results
Discussion
En conclusión, este informe se describen los métodos utilizados para cultivar las células iPS, iPS-EPR y EPR fetal. RPE derivadas de iPS son morfológicamente y funcionalmente similar al EPR fetal. El IPS-RPE también expresa los genes característicos de RPE incluyendo RPE65, CRALBP, PEDF y LRAT 16. Para caracterizar adicionalmente estas células, el ARN se extrae y se utiliza para realizar el análisis de microarrays para identificar diferencialmente expresado genes miARN. El análisis de las intensidade…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Las opiniones o afirmaciones contenidas en este documento son las opiniones privadas de los autores y no deben interpretarse como funcionario o como el reflejo de las opiniones del Departamento del Ejército o el Departamento de Defensa.
Esta investigación se lleva a cabo mientras los autores Whitney A. Greene, Alberto Muñiz, y Ramesh R. Kaini celebraron una Postdoctoral Research Associateship Consejo Nacional de Investigación en el USAISR.
Ensayos de microarrays se realizaron por la Infancia Greehey Instituto de Investigación del Cáncer Microarray Core Facilidad Departamento de Bioinformática en la UT Health Science Center de San Antonio.
Este trabajo fue apoyado por el Programa del Ejército de EE.UU. de Medicina Clínica de Rehabilitación de Investigación (CRMRP) y el Programa de Investigación de Medicina Militar Operacional (MOMRP).
Materials
| mTeSR1 media + 5X supplement | Stem Cell Technologies | 5850 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M-7154 | |
| Non essential amino acids | Hyclone(Fisher) | SH30853.01 | |
| Knockout serum replacement | Life Technologies | 10828-028 | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | |
| MEM media | Life Technologies | 10370-021 | |
| N1 supplement | Sigma | N-6530-5ML | |
| Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888-1G | |
| Fetal bovine serum | Hyclone(Fisher) | SH3008803HI | |
| Triiodo-l-thyronine sodium salt | Sigma | T6397 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881 | |
| Fetal RPE media RTEGM kit | Life Technologies | 195406 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| Phosphate buffered saline | Hyclone(Fisher) | 10010-023 | |
| Trypsin | Hyclone(Fisher) | 25200-072 | |
| Miltenyi Biotec washing buffer | StemGent | 130-092-987 | |
| Miltenyi Biotec rinsing buffer | StemGent | 130-092-222 | |
| Anti-TRA-1-60 microbead kit | StemGent | 130-095-816 | |
| Miltenyi Biotec cell sorter column | StemGent | 130-021-101 | |
| RNeasy micro kit | Qiagen | 74004 | |
| QIA shredder | Qiagen | 79654 | |
| RNA 6000 Pico LabChip kit | Agilent | G2938-90046 | |
| Human miRNA microarray v16 | Agilent | G4471A |
Referências
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