Bygging og karakterisering av en Novel Vocal Fold bioreaktor
Summary
A novel vocal fold bioreactor capable of delivering physiologically relevant, vibratory stimulation to cultured cells is constructed and characterized. This dynamic culture device, when combined with a fibrous poly(ε-caprolactone) scaffold, creates a vocal fold-mimetic environment that modulates the behaviors of mesenchymal stem cells.
Abstract
In vitro engineering of mechanically active tissues requires the presentation of physiologically relevant mechanical conditions to cultured cells. To emulate the dynamic environment of vocal folds, a novel vocal fold bioreactor capable of producing vibratory stimulations at fundamental phonation frequencies is constructed and characterized. The device is composed of a function generator, a power amplifier, a speaker selector and parallel vibration chambers. Individual vibration chambers are created by sandwiching a custom-made silicone membrane between a pair of acrylic blocks. The silicone membrane not only serves as the bottom of the chamber but also provides a mechanism for securing the cell-laden scaffold. Vibration signals, generated by a speaker mounted underneath the bottom acrylic block, are transmitted to the membrane aerodynamically by the oscillating air. Eight identical vibration modules, fixed on two stationary metal bars, are housed in an anti-humidity chamber for long-term operation in a cell culture incubator. The vibration characteristics of the vocal fold bioreactor are analyzed non-destructively using a Laser Doppler Vibrometer (LDV). The utility of the dynamic culture device is demonstrated by culturing cellular constructs in the presence of 200-Hz sinusoidal vibrations with a mid-membrane displacement of 40 µm. Mesenchymal stem cells cultured in the bioreactor respond to the vibratory signals by altering the synthesis and degradation of vocal fold-relevant, extracellular matrix components. The novel bioreactor system presented herein offers an excellent in vitro platform for studying vibration-induced mechanotransduction and for the engineering of functional vocal fold tissues.
Introduction
Den menneskelige stemmebånd fold, som består av en epitellaget, lamina propria (LP) og vocalis muskel, er en spesialisert mykt vev som konverterer luftstrøm fra lungene til akustiske bølger for god produksjon. Ett Stemme folder svinge regelmessig under normal phonation, oppviser stammer av opp til 30% ved fundamentale frekvenser som strekker seg 100 til 300 Hz. 2. Voksen stemmebånds LP er et gradient struktur sammensatt av et overfladisk (SLP), et mellomprodukt (ILP) og en dyp (DLP) lag. Ytterligere klassifiseringsgrupper epitel og SLP som slimhinnen lag, og kombinerer ILP og DLP inn vokalligament. 3 The SLP laget inneholder først og fremst en amorf matrise med tynt spredt collagenous fibre, mens ligament er beriket med modne kollagen og elastin fiber å gi tilstrekkelig styrke. 4 Strukturen og mekanikk av nyfødte stemmebåndene varierer betydelig fra sine modne kolleger. Selv om mekanismens regulerer vokal fold utvikling og modning er ennå ikke fullt ut forstått, eksperimentelle bevis har pekt på de definerende roller vokalisering-avledet mekanisk stress.
Flere medisinske tilstander, inkludert tale misbruk, infeksjoner, kjemiske irritanter og kirurgiske prosedyrer, kan skade vokal fold. Vokal fold lidelser påvirker anslagsvis 3-9% av den amerikanske befolkningen. Aktuelle behandlingsmetoder for vokal fold lidelser er begrenset fem og en stamcelle-baserte tissue engineering tilnærming har dukket opp som en lovende strategi for å gjenopprette vokal fold funksjon. Mesenchymale stamceller (MSCS) er et egnet alternativ til de primære vokal fold fibroblaster for vokal fold tissue engineering. 6-9 Stamcelle skjebne spesifikasjon og påfølgende vev utvikling er mediert av den spesifikke nisje de bor i, som den mekaniske tilstanden er en avgjørende faktor. 10 Mekaniske krefter er viktige regulatorer av vev morphogenesis ennd homeostase, spesielt for vev som er rutinemessig utsatt for belastning. 11. Fra et vevsteknologi perspektiv, har det blitt demonstrert at eksponering for fysiologisk relevante mekaniske stimuler fremmer stamcelledifferensiering og vev-spesifikk matrise ombygging. 12-15
Tissue culture bioreaktorer er utformet til å simulere det ønskede fysiologisk miljø for celle eller vev vekst in vitro. For vokal fold tissue engineering, er det spesielt viktig å gjenskape den mekaniske miljøet av phonating stemmebåndene. En ideell vokal fold bioreaktor bør effektivt levere vibrerende signaler til kultur celler, slik at lettvinte kontroll over frekvens, amplitude og varighet av vibrasjoner. Titze og kolleger utviklet en vokal fold bioreaktor (T1 bioreaktor) 16 som kombinerer statisk strekk med høy frekvens (20-200 Hz) svingninger å stimulere celleproduksjon av matrix proteiner. Using dette bioreaktor, Webb og kolleger 17 studert virkningen av 10-dagers 100-Hz vibrasjoner på dermale fibroblaster dyrket i en hyaluronsyre (HA)-baserte hydrogel. Konstruksjoner som er utsatt for vibrasjon oppviste en forhøyet ekspresjon av HA-syntase-2 (has2), decorin, fibromodulin and matrix metalloproteinase-1 (MMP1), i forhold til de statiske kontroller. De stimulerende effekt ble funnet å være tidsavhengig. Mer nylig vår gruppe 18 montert en stemmebånds bioreaktor (J1 bioreaktor) ved hjelp av en kraftforsterker, en funksjonsgenerator, et lukket høyttaler og en omkretsmessig forankret silikonmembran som overfører oscillerende luft til de festede celler. Neonatal forhud fibroblaster dyrket i J1 bioreaktoren ble utsatt for en time for vibrasjon ved 60, 110 eller 300 Hz, med en in-plane belastning på opp til 0,05%. De qPCR Resultatene antydet at ekspresjonen av enkelte ECM gener var moderat endres i respons til de varierte vibrasjonsfrekvenserog amplituder.
Disse bioreaktor design, mens spennende, har flere begrensninger. For eksempel krever T1 systemet et stort antall av kontakter og stenger for mekanisk kopling, som begrenser den maksimale oppnåelige frekvenser. Videre kan cellene være utsatt for uønsket mekanisk agitasjon og fluid perturbasjon som komplisere tolkningen av data. Den J1 bioreaktor, på den annen side oppviser relativt lav energikonverteringseffektiviteten og er ikke brukervennlige. I tillegg vibrasjoner ofte løsner celle-laden konstruksjoner fra den underliggende silikonmembranen. Den J2 vokal fold bioreaktor rapportert her, designet basert på samme prinsipp som J1-versjonen er optimalisert for konsistens og reproduserbarhet. De phonation-etterligne vibrasjoner genereres aerodynamisk i individuelt montert vibrasjons kamre der MSC-befolket fiber poly (ε-kaprolakton) (PCL) stillasene er effektiviely sikret. Laser Doppler Vibrometry (LDV) lar brukeren kontrollere vibrasjons profil av membran / stillas montering. I vår demonstrasjonen blir MSCS eksponert for 200 Hz sinusformede svingninger med en 1-timers-on-1-t-av (OF) mønster for totalt 12 timers daglig i 7 dager. Cellulære responser til de pålagte vibrerende signaler er undersøkt systematisk. Totalt er den J2 vokal fold de mest brukervennlige funksjoner, slik at dynamiske cellekulturstudier som skal utføres i en høy gjennomstrømning og reproduserbar måte.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vellykket engineering av funksjonelle vokal fold vev in vitro krever rekreasjon av en vokal fold-lignende mikromiljøet å megle atferd av multipotente celler. Det er generelt akseptert at vevs-eller organ-strukturer reflektere de funksjoner som er nødvendige for å utføre. 22. For stemmebånds vev, blir de høyfrekvente vibrasjoner som oppstår under phonation foreslått å være viktig for vev modning. I vår studie, er PCL stillasene brukes til å gi et ligament-lignende strukturell støtte mens…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. Jeffrey Caplan for sin opplæring og råd om confocal bildebehandling. Vi takker også Keck Elektronmikros Lab og Dr. Chaoying Ni for SEM assistanse. Dette arbeidet er finansiert av National Institutes of Health (NIDCD, R01DC008965 og R01DC011377). ABZ erkjenner NSF Integrative Graduate Education & Research Praksisplass (IGERT) program for finansiering.
Materials
| silicone elastomer kit | Dow Corning | Sylgard 184 | cure the membrane at 100 C for 2 hr |
| PCL | Sigma Aldrich | 440744-500G | Mn ~ 80 kDa, dissolve overnight |
| chloroform | Sigma Aldrich | C7559-5VL | |
| human bone marrow-derived MSCs | Lonza | PT-2501 | received with passage 2 |
| MSC maintenance media | Lonza | PT-3001 | 10% FBS in basal media supplemented with L-glutamine, gentamicin and amphotericin |
| Accutase cell dissociation reagent | Life Technologies | A11105-01 | |
| ethanol | Sigma Aldrich | E7023-500ML | |
| fibronectin | Sigma Aldrich | F2006-1MG | |
| MMP1 DuoSet ELISA kit | R&D systems | DY901 | |
| HA ELISA kit | Echelon Biosciences | K-1200 | |
| PBS | Life Technologies | 14190-136 | |
| propidium iodide | Life Technologies | P1304MP | |
| Syto-13 | Life Technologies | S7575 | |
| QuantiTect reverse transcription kit | Qiagen | 205311 | |
| SYBR Green PCR master mix | Life Technologies | 4309155 | |
| replacement speaker | DAYTON audio (via Parts Express) |
DS90-8 | paper cone, full range (80-13000 Hz), 85dB |
| Ergo Micro torque screwdriver | Mountz | # 020377 | torque range: 20-120 cN.m |
| stereo speaker selector | RadioShack | 40-244 | maximum power handling 50 W |
| function generator | Agilent | 33220A | frequency range 1 µHz- 20 MHz |
| power amplifier | PYLE audio | PylePro PT2400 | frequency response: 10 Hz-50 kHz, two speaker channels |
| cell culture incubator | Thermo Fisher | Steri-Cult 3307 | |
| syringe pump | New Era Pump Systems | NE-300 | |
| High voltage power supply | Spellman | CZE 1000R | output voltage: 0-30 kV |
| scanning electron microscope | JEOL-USA | JSM-7400F | |
| desk gold sputter coater | Denton Vacuum | DSK00V-0013 | |
| Doppler laser vibrometer | Polytec | PDV-100 | non-contact velocity measurement (0-22 kHz) |
| PCR sequence detection system | Applied Biosystems | ABI7300 | |
| multiphoton confocal microscope | Zeiss | Zeiss 510Meta NLO | |
| UV-VIS Spectrophotometer | NanoDrop Products via Thermo Scientific |
ND-2000 | |
| VibSoft Data Acquisition Software | Polytec | acquisition bandwidth up to 40 MHz | |
| Origin 8.5 data analysis software | OriginLab | ||
| qbasePlus qPCR data analysis software | Biogazelle | V2.3 | |
| aluminium alloy | McMaster-Carr | Alloy 6061 | |
| acrylic blocks | McMaster-Carr | ||
| polycarbonate anti-humidity chamber | McMaster-Carr | Impact-Resistant Polycarbonate | |
| screws | McMaster-Carr | ||
| electronic cable/wire | |||
| medical grade PVC tubing | US Plastic Corp. | Tygon S-50-HL | clear, biocompatible |
| 10 mL syringe | Becton Dickinson | 309604 | |
| 21 G blunt ended needle | Small Parts | NE-213PL-25 | 1-1/2" length |
| Alligator clip adapters | RadioShack | 270-354 | fully insulated |
| 8 mm biopsy punch | Sklar Surgical Instruments | 96-1152 | sterile, disposable |
| 12 mm biopsy punch | Acuderm (via Fisher Scientific) | NC9998681 | |
| tissue culture flasks | Corning | cell culture treated |
Referências
- Titze, I. R. Mechanical-Stress in Phonation. J. Voice. 8, 99-105 (1994).
- Titze, I. R. On the Relation Between Subglottal Pressure and Fundamental-Frequency in Phonation. J. Acoust. Soc. Am. 85, 901-906 (1989).
- Gray, S. D. Cellular physiology of the vocal folds. Otolaryngol. Clin. N. Am. 33, 679-698 (2000).
- Thibeault, S. L., Gray, S. D., Bless, D. M., Chan, R. W., Ford, C. N. Histologic and rheologic characterization of vocal fold scarring. J. Voice. 16, 96-104 (2002).
- Hansen, J. K., Thibeault, S. L. Current understanding and review of the literature: Vocal fold scarring. J. Voice. 20, 110-120 (2006).
- Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284, 143-147 (1999).
- Hanson, S. E., et al. Characterization of Mesenchymal Stem Cells From Human Vocal Fold Fibroblasts. Laryngoscope. 120, 546-551 (2010).
- Tong, Z., Duncan, R. L., Jia, X. Modulating the behaviors of mesenchymal stem cells via the combination of high-frequency vibratory stimulations and fibrous scaffolds. Tissue Eng. Part A. 19, 1862-1878 (2013).
- Tong, Z., Sant, S., Khademhosseini, A., Jia, X. Controlling the Fibroblastic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells Via the Combination of Fibrous Scaffolds and Connective Tissue Growth Factor. Tissue Eng. Part A. 17, 2773-2785 (2011).
- Jones, D. L., Wagers, A. J. No place like home: anatomy and function of the stem cell niche. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 11-21 (1038).
- Wang, J. H., Thampatty, B. P. Mechanobiology of Adult and Stem Cells. Int. Rev. of Cell Mol. Biol. 271, 301-346 (2008).
- Doroski, D. M., Levenston, M. E., Temenoff, J. S. Cyclic tensile culture promotes fibroblastic differentiation of marrow stromal cells encapsulated in poly (ethylene glycol)-based hydrogels. Tissue Eng. Part A. 16, 3457-3466 (2010).
- Kim, B. S., Nikolovski, J., Bonadio, J., Mooney, D. J. Cyclic mechanical strain regulates the development of engineered smooth muscle tissue. Nat. Biotechnol. 17, 979-983 (1999).
- Webb, K., et al. Cyclic strain increases fibroblast proliferation, matrix accumulation, and elastic modulus of fibroblast-seeded polyurethane constructs. J. Biomech. 39, 1136-1144 (2006).
- Kim, Y. J., Sah, R. L. Y., Grodzinsky, A. J., Plaas, A. H. K., Sandy, J. D. Mechanical Regulation of Cartilage Biosynthetic Behavior – Physical Stimuli.. Arch. Biochem. Biophys. 311, 1-12 (1994).
- Titze, I. R., et al. Design and validation of a bioreactor for engineering vocal fold tissues under combined tensile and vibrational stresses. J. Biomech. 37, 1521-1529 (2004).
- Kutty, J. K., Webb, K. Vibration stimulates vocal mucosa-like matrix expression by hydrogel-encapsulated fibroblasts. J. Tissue Eng. Regen. Med. 4, 62-72 (2010).
- Farran, A. J. E., et al. Design and Characterization of a Dynamic Vibrational Culture System. J. Tissue Eng. Regen. Med. , (2011).
- Reneker, D. H., Yarin, A. L. Electrospinning jets and polymer nanofibers. Polymer. 49, 2387-2425 (2008).
- Wang, Y., Theobald, P., Tyrer, J., Lepper, P. The application of scanning vibrometer in mapping ultrasound fields. J. Phys.: Conf. Ser. 1, 167-173 (2004).
- Brown, W. S., Morris, R. J., Hollien, H., Howell, E. Speaking Fundamental-Frequency Characteristics as a Function of Age and Professional. J. Voice. 5, 310-315 (1991).
- Ingber, D. E. Cellular mechanotransduction: putting all the pieces together again. Faseb J. 20, 811-827 (2006).
- Titze, I. R., et al. Design and validation of a bioreactor for engineering vocal fold tissues under combined tensile and vibrational stresses. J. Biomech. 37, 1521-1529 (2004).
- Moore, J., Thibeault, S. Insights Into the Role of Elastin in Vocal Fold Health and Disease. J. Voice. 26, 269-275 (2012).
- Thibeault, S. L., Bless, D. M., Gray, S. D. Interstitial protein alterations in rabbit vocal fold with scar. J. Voice. 17, 377-383 (2003).
- Branski, R. C., Verdolini, K., Sandulache, V., Rosen, C. A., Hebda, P. A. Vocal fold wound healing: A review for clinicians. J. Voice. 20, 432-442 (2006).
- Clark, I. A., Swingler, T. E., Sampieri, C. L., Edwards, D. R. The regulation of matrix metalloproteinases and their inhibitors. Int. J. Biochem. Cell B. 40, 1362-1378 (2008).
- Silver, F. H., Horvath, I., Foran, D. J. Viscoelasticity of the vessel wall: The role of collagen and elastic fibers. Crit. Rev. Biomed. Eng. 29, 279-301 (2001).
- Kutty, J. K., Webb, K. Tissue Engineering Therapies for the Vocal Fold Lamina Propria. Tissue Eng. Part B: Rev. 15, 249-262 (2009).
