Reverse genetica Morpholino approccio Uso cardiaca ventricolare iniezione per transfettare diversi tessuti difficili da bersaglio in Zebrafish Larva
Summary
Un metodo genetica inversa adattabile per zebrafish per valutare la funzione del gene durante le fasi successive di sviluppo e omeostasi fisiologica, come la rigenerazione dei tessuti utilizzando iniezioni intraventricolare di Morpholinos gene-specifici.
Abstract
Lo zebrafish è un modello importante per comprendere la biologia cellulare e molecolare di organo e rigenerazione appendice. Tuttavia, le strategie molecolari di impiegare genetica inversa non sono ancora stati adeguatamente sviluppati per valutare la funzione del gene nella rigenerazione o omeostasi dei tessuti durante le fasi larvali dopo embriogenesi zebrafish, e diversi tessuti all'interno della larva zebrafish sono difficili da colpire. Iniezioni intraventricolare di Morpholinos gene-specifici offrono un metodo alternativo per l'attuale incapacità di indirizzare genomically geni di zebrafish in modo controllato temporalmente in queste fasi. Questo metodo consente la completa dispersione e successiva incorporazione del morfolino in vari tessuti dell'organismo, comprese le strutture che prima erano impossibili da raggiungere come quelli nella pinna caudale larvale, una struttura spesso usato per ricercare in modo non invasivo rigenerazione tissutale. Diversi geni attivati durante la rigenerazione finfold larvale sono anche Present nella rigenerazione dei tessuti vertebrati adulti, in modo che la larva è un modello utile per capire la rigenerazione negli adulti. Questo metodo dispersione morfolino consente l'identificazione rapida e facile di geni necessari per la rigenerazione di tessuti larvali nonché altri fenomeni fisiologici che regolano l'omeostasi del tessuto dopo l'embriogenesi. Pertanto, questo metodo di consegna fornisce una strategia attualmente necessari per il controllo temporale per la valutazione della funzione genica dopo embriogenesi.
Introduction
Rigenerazione di organi e appendici è di fondamentale importanza per la sopravvivenza e fitness; Tuttavia, alcuni vertebrati compreso l'uomo hanno limitato la capacità rigenerative. Mentre diversi modelli animali esistere che hanno ampia capacità rigenerativa, invertire tecniche genetiche per valutare la funzione del gene durante organo e la rigenerazione appendice rimangono molto limitato o inesistente. Pertanto, sono necessari nuovi approcci per sezionare la biologia molecolare di rigenerazione in questi organismi modello.
Il zebrafish è un modello ben consolidato per comprendere la biologia cellulare e molecolare di organo e rigenerazione appendice 1, non solo per la sua notevole capacità di rigenerare più organi, tessuti e appendici, ma anche perché diverse linee transgeniche di pesce esistono per monitorare le cellule e di iperespressione del gene costruisce 2, 3. Tuttavia, l'inibizione del gene in zebrafish larvale è limitata principalmente al overexpreSsion di costrutti dominanti negativi, che non sono a disposizione di tutti i geni di interesse o il cui prodotto del transgene in grado di acquisire il guadagno-di-funzione degli effetti che non riflettono l'attività endogena del gene. Pertanto, è necessario un metodo alternativo per rimuovere specificamente espressione genica per KO o smontabile per superare questi problemi.
Gene-specifica il targeting utilizzando TALENS esiste come un mezzo genetica inversa per knockout funzione del gene; Tuttavia, questa strategia knockout è molto spesso limitata a valutazioni funzionali durante embriogenesi precoce, perché i requisiti iniziali del gene impedire ulteriore progressione dello sviluppo embrionale. Così, studiando i fenomeni successivi come la rigenerazione o organo omeostasi dopo di sviluppo utilizzando TALENS è preclusa 4, 5. Pertanto, è necessaria una strategia di rimozione gene supplente che gli obiettivi di funzione del gene dopo lo sviluppo presto per valutare i requisiti del gene in organi e strutture completamente formate. </p>
Morfolino iniezione ha dimostrato di essere efficace nel rivolti geni in alcuni organi adulti e l'adulto rigenerante pinna 6-8, ma questi metodi richiedono elettroporazione e molti organi interni sono difficili da elettroporazione sia a causa della loro posizione o per la loro sensibilità elettrica interruzioni. Inoltre, alcuni tessuti del larva sono difficili da iniettare direttamente, perché l'iniezione diretta può compromettere la loro integrità strutturale o perché la loro dimensione è limitante. La pinna caudale della larva è una tale struttura, in quanto l'iniezione diretta nel finfold non è possibile. Così, alternativa alla elettroporazione e iniezione diretta era necessaria per indirizzare geni nei tessuti che sono o troppo piccolo per iniettare o non possono essere elettroporate.
Al fine di indirizzare e inibire la funzione dei geni specifici durante la rigenerazione della pinna caudale larvale, abbiamo modificato morpholino tecnologie esistenti consentendo unVALUTAZIONE della funzione del gene durante la rigenerazione pinna caudale in larva tardo-messa in scena. Questo metodo impiega consegna intraventricolare 9 del Morpholinos fluoresceina-tagged con Endo-Porter trasfezione reagente 10. Una volta nel ventricolo, la miscela morfolino-Endo-Porter diffonde rapidamente in tutto il larva attraverso il sistema vascolare ed entra tessuti che sono stati precedentemente impossibile bersaglio. Questo metodo di iniezione può essere modificato per geni bersaglio in tessuti specifici e molto probabilmente può essere applicato in altri modelli animali che attualmente mancano metodi genetici inverso per inibire la funzione del gene. Così, offre un metodo rapido e facile con la possibilità di ampio utilizzo gamma di studiare immediatamente la funzione del gene durante l'omeostasi organo generale e rigenerazione nelle fasi larvali.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'iniezione intraventricolare fornisce un metodo di valutazione rapida e affidabile per analizzare la funzione genica nelle fasi successive di sviluppo o di omeostasi del corpo senza alterare la funzione del gene durante l'embriogenesi. Per assicurare il successo di questa tecnica, si deve essere consapevoli di quattro punti critici: 1) dimensioni dell'ago, 2) essiccazione dell'ago, 3) minimizzare il volume, e 4) tempo di esposizione minima nella soluzione sedazione. Aghi che sono troppo piccoli saranno …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), desideriamo ringraziare Ayele Tsedeke Taddese per il supporto tecnico.
Materials
| Company | Catalog Number | Comments/Description | |
| Reagent/Material | |||
| Morpholino with 3´fluorescein tag | Gene Tools Inc. | Customized | More information on www.genetools.com |
| Endo-Porter | Gene Tools Inc. | More information on www.genetools.com | |
| Agarose | Serva | 120623 | For pouring plates to place the fish during injections and imaging |
| Tricane (L-Ethyl-m-amino-benzate-methane sulfonate) | Applichem | For anesthesia | |
| E3 medium (5 mM NaCl; 0.17 mM KCl; 0.33 mM CaCl2; 0.33 mM MgSo4) | For larval husbandry | ||
| Petri Dishes | Sarstedt | 821.472 | For placing the fish during injections and imaging |
| Equipment | |||
| Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments, Inc. | TW100F-3 | For preparing injection needles |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5,242,956,003 | For loading the needle |
| Pasteur Pipettes (3 ml/1 ml) | Brand | 747760/ 74775 | For transfering larva |
| Flaming / Brown needle puller | Sutter | More information on www.sutter.com | |
| Watchmaker (Dumont) Tweezers (size 5) | World Precision Instruments, Inc. | 501985 | To brake the needle before sharpening |
| Dissecting microscope | Olympus, Leica, Zeiss | Varies with the manufacturer | Part of the whole injection setup |
| Fluorescence camera | Olympus, Leica, Zeiss | Varies with the manufacturer | To image the fluorescence after injeciton |
| PicoNozzle kit (microinjector holder) | World Precision Instruments | 5430-12 | For microinjections |
| Pneumatic PicoPump (microinjector) | World Precision Instruments | SYS-PV820 | For microinjections |
Referências
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