Реверс Генетическая Морфолино подход с использованием Сердечная желудочка Injection для трансфекции нескольких трудных для тканей-мишеней в данио рерио Личинка
Summary
Адаптируется обратная генетический метод для рыбок данио, чтобы оценить функции генов во время более поздних стадиях развития и физиологического гомеостаза, таких как регенерации тканей с использованием внутрижелудочковое инъекции гена конкретных Morpholinos.
Abstract
Данио является важной моделью для понимания клеточной и молекулярной биологии из органа и регенерации придаток. Однако молекулярные стратегии используют обратной генетики еще не были адекватно разработаны для оценки функции гена в регенерации или тканевого гомеостаза во время личиночной стадии после данио эмбриогенеза, и несколько тканей внутри данио личинки трудно цели. Внутрижелудочковые инъекции гена конкретных Morpholinos предложить альтернативный метод для текущего неспособности геномно генов-мишеней данио в временно контролируемым образом на этих этапах. Этот метод позволяет полностью дисперсии и последующей инкорпорации морфолино в различных тканях организма, в том числе структур, которые раньше были невозможно достичь таких, как в личиночной хвостового плавника, структуры часто используется для неинвазивного исследования регенерации тканей. Некоторые гены активированные во время личиночной регенерации finfold также изложет в регенерации тканей взрослых позвоночных, так что личинка является полезной моделью для понимания регенерации у взрослых. Этот метод морфолино дисперсии позволяет быстро и легкой идентификации генов, необходимых для регенерации тканей личинки, а также других физиологических феноменов, регулирующих тканевого гомеостаза после эмбриогенеза. Таким образом, этот способ доставки обеспечивает в настоящее время необходимо стратегию временного контроля к оценке функции гена после эмбриогенеза.
Introduction
Регенерация органов и придатков принципиально важно для выживания и фитнеса; однако, несколько позвоночные, включая человека имеют ограниченный регенеративные способности. В то время как несколько моделей животных существуют, которые имеют большой регенеративную способность, обратный генетические методы для оценки функции гена во органа и регенерации придаток остаются весьма ограничены или вообще отсутствуют. Поэтому необходимы новые подходы препарировать молекулярной биологии регенерации в этих модельных организмов.
Данио является хорошо известной моделью для понимания клеточной и молекулярной биологии органной и придаток регенерации 1, не только из-за его значительной способности регенерировать несколько органов, тканей и придатков, но и потому, что несколько трансгенные рыбы линии существуют, чтобы отслеживать клетки и для сверхэкспрессии гена конструкции 2, 3. Однако ингибирование генов в личиночной данио в основном ограничивается overexpression доминантных-отрицательных конструкций, которые не доступны для всех интересующих генов или чьи трансгенный продукт может приобрести усиления из-функции эффектов, которые не отражают эндогенный активность гена. Таким образом, альтернативный метод для удаления конкретно экспрессию гена нокаутом или нокдауна, чтобы преодолеть эти проблемы.
Джин конкретных таргетинга с помощью TALENS существует в качестве обратного генетических средств нокаутом функции гена; Однако, эта стратегия нокаут очень часто ограничивается функциональных оценок в ходе раннего эмбриогенеза, потому первоначальные требования гена предотвратить дальнейшее прогрессирование эмбрионального развития. Таким образом, изучение поздние явления, такие как регенерации или органа гомеостаза после разработки с использованием Talens исключается 4, 5. Таким образом, альтернативный стратегия удаление гена необходим, что цели функции гена после раннего развития для оценки потребностей генов в полностью сформированных органов и структур. </р>
Морфолино инъекции, как было показано, чтобы быть эффективным в ориентации генов в несколько органов взрослых и взрослых регенерации ребра 6-8, однако эти методы требуют электропорацию и многие внутренние органы трудно электропорации либо из-за их расположения или из-за их чувствительности к электрической нарушение. Кроме того, некоторые ткани в личинки трудно придать непосредственно, потому что прямой впрыск может нарушить их структурную целостность или потому, что их размер ограничивает. Хвостовой плавник личинки является одним из таких структура, потому что прямой впрыск в finfold невозможно. Таким образом, альтернативой электропорации и непосредственным впрыском было необходимо, чтобы гены-мишени в тканях, которые либо слишком малы, чтобы придать или не может быть электропорации.
В целях выявления и ингибировать функцию специфических генов при регенерации личиночной хвостового плавника, мы изменили существующие технологии морфолино позволяяssessment функции генов в процессе хвостового плавника регенерации в конце-поставил личинки. Этот метод использует внутрижелудочковую доставку 9 флуоресцеина с метками Morpholinos вместе с Эндо-Портера трансфекции реагента 10. После того, как в желудочке, смесь морфолино-Эндо-Porter быстро распространяется по всей личинки через сосудистую и входит тканей, которые были ранее невозможно цели. Этот метод инъекции может быть изменен, чтобы генов-мишеней в конкретных тканях и, вполне возможно, могут быть применены в других моделях на животных, которые в настоящее время отсутствуют обратные генетические методы, чтобы ингибировать функцию гена. Таким образом, он предлагает быстрый и простой способ с потенциалом для широкого использования диапазона немедленно изучения функции генов во время общей гомеостаза органов и регенерации в личиночной стадии.
Protocol
Representative Results
Discussion
Внутрижелудочковое впрыска обеспечивает быстрый и надежный метод оценки для тестирования функции гена на более поздних стадиях развития или боди гомеостаза, не влияя на функцию гена во время эмбриогенеза. Для обеспечения успеха этого метода, следует иметь в виду из четырех критическ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), мы хотели бы поблагодарить Айеле Tsedeke Taddese за технической поддержкой.
Materials
| Company | Catalog Number | Comments/Description | |
| Reagent/Material | |||
| Morpholino with 3´fluorescein tag | Gene Tools Inc. | Customized | More information on www.genetools.com |
| Endo-Porter | Gene Tools Inc. | More information on www.genetools.com | |
| Agarose | Serva | 120623 | For pouring plates to place the fish during injections and imaging |
| Tricane (L-Ethyl-m-amino-benzate-methane sulfonate) | Applichem | For anesthesia | |
| E3 medium (5 mM NaCl; 0.17 mM KCl; 0.33 mM CaCl2; 0.33 mM MgSo4) | For larval husbandry | ||
| Petri Dishes | Sarstedt | 821.472 | For placing the fish during injections and imaging |
| Equipment | |||
| Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments, Inc. | TW100F-3 | For preparing injection needles |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5,242,956,003 | For loading the needle |
| Pasteur Pipettes (3 ml/1 ml) | Brand | 747760/ 74775 | For transfering larva |
| Flaming / Brown needle puller | Sutter | More information on www.sutter.com | |
| Watchmaker (Dumont) Tweezers (size 5) | World Precision Instruments, Inc. | 501985 | To brake the needle before sharpening |
| Dissecting microscope | Olympus, Leica, Zeiss | Varies with the manufacturer | Part of the whole injection setup |
| Fluorescence camera | Olympus, Leica, Zeiss | Varies with the manufacturer | To image the fluorescence after injeciton |
| PicoNozzle kit (microinjector holder) | World Precision Instruments | 5430-12 | For microinjections |
| Pneumatic PicoPump (microinjector) | World Precision Instruments | SYS-PV820 | For microinjections |
Referências
- Gemberlin, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends in Genetics. 29, 611-620 (2013).
- Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish. Nature Protocols. 6, 2011 (1998).
- Skromne, I., Prince, V. E. Current perspectives in zebrafish reverse genetics: moving forward. Developmental Dynamics. 237, 861-882 (2008).
- Zu, Y., et al. TALEN-mediated precise genome modification by homologous recombination in zebrafish. Nature Protocols. 10, 329-332 (2013).
- Bedell, V. M., et al. In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature. 491, 114-118 (2012).
- Kizil, C., IItzsche, A., Kaslin, J., Brand, M. Micromanipulation of gene expression in the adult zebrafish brain using cerebroventricular microinjection of morpholino oligonucleotides. J Vis Exp. , (2013).
- Hyde, D., Godwin, A., Thummel, R. In vivo electroporation of morpholinos into the regenerating adult zebrafish tail fin. J Vis Exp. , (2012).
- Thummel, R., Bailey, T., Hyde, D. In vivo electroporation of morpholinos into the adult zebrafish retina. J Vis Exp. , (2011).
- Rieger, S., Kulkarni, R. P., Darcy, D., Fraser, S. E., Köster, R. W. Quantum dots are powerful multipurose vital labeling agents in zebrafish embryos. Developmental Dynamics. 234, 670-681 (2005).
- Madhavan, M., et al. The role of Pax-6 in lens regeneration. Proceedings of the National Academy of Science U. 103, 14848-14853 (2006).
- Gilmour, D. T., Jessen, J. R., Lin, S. . Zebrafish: a practical approach. 261, 121-143 (2000).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Eisen, J. S., Smith, J. C. Controlling morpholino experiments: don’t stop making antisense. Development. 135, 1735-1743 (2008).
- Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. A primer for morpholino use in zebrafish. Zebrafish. 6, 69-77 (2009).
- Hyatt, T. M., Ekker, S. C. Vectors and techniques for ectopic gene expression in zebrafish. Methods Cell Biol. 59, 117-126 (1999).
- Hans, S., Kaslin, J., Freudenreich, D., Brand, M. Temporally controlled site-specific recombination in zebrafish. PLoS One. 4, (2009).
- Lee, Y., Grill, S., Sanchez, A., Murphy-Ryan, M., Poss, K. D. Fgf signaling instructs position-dependent growth rate during zebrafish fin regeneration. Development. 132, 5173-5183 (2005).
- Liu, S., D, L. S. Zebrafish models for cancer. Annu. Re. Pathol. Mech. Dis. 6, 71-93 (2011).
- Stoick-Cooper, C. L., et al. Distinct Wnt signaling pathways have opposing roles in appendage regeneration. Development. 134, 479-489 (2007).
- Shen, S. P., Aleksic, J., Russell, S. Identifying targets of the Sox domain proteins Dichaete in the Drosophila CNS via targeted expression of dominant negative proteins. BMC Dev. Biol. 13, (2013).
- McNeish, J. D., Scott, W. J., Potter Jr, S. S. Legless, a novel mutation found in PHT1-1 transgenic mice. Science. 241, 837-839 (1988).
- Covarrubias, L., Nishida, Y., Terao, M., D’Eustachio, P., Mintz, B. Cellular DNA rearrangements and early developmental arrest caused by DNA insertion in transgenic mouse embryos. Mol. Cell. Biol. 7, 2243-2247 (1987).
