Zebra balığı Larva Çoklu Zor-hedef dokular geçiştirilmesi için Kardiyak Ventriküler Injection kullanarak Genetik Morfolino Yaklaşım ters
Summary
Bu tür gen-spesifik morpholinos intraventriküler enjeksiyonları kullanarak doku rejenerasyonu gibi gelişme ve fizyolojik homeostasis sonraki aşamalarında gen fonksiyonunu değerlendirmek için zebrabalıkları için uyarlanabilir ters genetik bir yöntem.
Abstract
Zebra balığı hücre ve organ ve apendiks yenilenme moleküler biyolojisini anlamak için önemli bir modeldir. Ancak, ters genetik istihdam moleküler stratejiler henüz yeterince Zebrafish embriyogenezin sonra larva dönemlerinde rejenerasyon veya doku homeostazisindeki gen fonksiyonunu değerlendirmek için geliştirilmiş değil, ve Zebra balığı larva içinde çeşitli dokuları hedeflemek için zordur. Gene özgü morpholinos intraventriküler enjeksiyonlar genomik bu aşamalarda, bir zamansal olarak kontrollü bir şekilde zebra balığı genlerin hedef mevcut yetersizlik için alternatif bir yöntem sunar. Bu yöntem, daha önce bu tür larva kuyruk kanadı, genellikle, invaziv olmayan doku yenilenmesini aratmak için kullanılan bir yapı gibi ulaşmak mümkün olmayan yapılar dahil olmak üzere, vücutta çeşitli dokular içine tam dağılım ve morfolino sonraki dahil edilmesine imkan verir. Larva finfold rejenerasyon sırasında aktive edilen çeşitli genler de Presen ediliryetişkin omurgalı doku yenileyici t, yani larva erişkinlerde rejenerasyon anlamak için bir modeldir. Bu yöntem, morfolino dağılım larva doku tamiri gibi embriyojenez sonra doku homeostazını düzenleyen diğer fizyolojik olayları için gerekli genlerin hızlı ve kolay tanımlanması için gereklidir. Bu nedenle, bu dağıtım yöntemi embriyojenez sonra gen fonksiyonunun değerlendirilmesi için zamansal kontrol için şu anda ihtiyaç strateji sağlar.
Introduction
Organ ve ekleri rejenerasyon yaşam ve spor için temelde önemli olan; Ancak, insan dahil birçok omurgalı rejeneratif yetenekleri sınırlıdır. Çeşitli hayvan modellerde kapsamlı rejeneratif kapasiteye sahip olduğunu mevcut olmakla birlikte, organ ve apendiks rejenerasyon sırasında gen fonksiyonunu değerlendirmek için genetik teknikler ters çok sınırlı ya da varolmayan kalır. Bu nedenle, yeni yaklaşımlar bu model organizmaların yenilenme moleküler biyoloji incelemek gerekmektedir.
Zebra balığı birkaç transgenik balık hatları hücreleri izlemek için var, çünkü hücre ve nedeniyle önemli çoklu organ, doku ve uzantıları yeniden yeteneği, ama aynı zamanda değil tek organ ve apendiksinde rejenerasyon 1, moleküler biyoloji anlamak için iyi kurulmuş bir modeldir ve genini aşırı ifade eden 2, 3, oluşturur. Bununla birlikte, larva Zebrafish gen inhibisyonu esas olarak overexpre sınırlıdırolan transgen ürünü genin endojen aktivitesi yansıtmamaktadır kazanç fonksiyon-etkilerini elde etmek için her ilgi genleri ya da mevcut değildir dominant-negatif yapılar, salgılanması. Bu nedenle, özel olarak nakavt veya demonte gen ifadesini ortadan kaldırmak için alternatif bir yöntem, bu sorunların üstesinden gelmek için gereklidir.
TALENS gen fonksiyonu nakavt için ters genetik aracı olarak kullanan mevcut gen hedefleme özgü; genin ilk gereksinimleri embriyonik gelişimin ilerleyişi önlemek çünkü ancak, bu nakavt strateji, çok sık erken embriyonik dönemde fonksiyonel değerlendirmelere sınırlıdır. Dolayısıyla, bu tür Talens kullanarak geliştirme sonra rejenerasyon veya organ homeostasisin sonraları olayları inceleyerek, 5 4 engellenir. Bu nedenle, alternatif bir gen çıkarma stratejisi tamamen oluşmuş organ ve yapıların gen gereksinimlerini değerlendirmek için erken gelişme sonrası gen işlevini hedefleyen ihtiyaç duyulmaktadır. </p>
Morfolino enjeksiyon birkaç yetişkin organlarında genleri hedef ve yetişkin fin 6-8 rejenere etkili olduğu gösterilmiştir, ancak bu yöntemler elektroporasyon gerektiren ve çok iç organları nedeniyle konuma veya dolayı elektrik duyarlılıklarına ya electroporate zordur bozulması. Doğrudan enjeksiyon yapısal bütünlüğünü bozabilir, çünkü ya da boyut sınırlayıcı olduğu için Dahası, larva bazı dokular doğrudan enjekte etmek zordur. Finfold içine direkt enjeksiyon mümkün değil çünkü larva kuyruk yüzgeci, böyle bir yapıdır. Bu nedenle, elektroporasyon ve direkt enjeksiyon için alternatif ya da enjekte etmek için çok küçük ya da elektroporasyona edilemez dokularda genlerin hedeflenmesi için gerekli idi.
Larva kuyruk yüzgeci rejenerasyon sırasında belirli genlerin işlevini inhibe etmek ve hedef amacıyla, mevcut morfolino sağlayan teknolojiler değiştirilmiş olan birGeç-aşamalı larva kuyruk yüzgeci rejenerasyon sırasında gen fonksiyonu ssessment. Bu yöntem, bir arada Endo-Porter transfeksiyon reaktifi 10, fluorescein-etiketli morpholinos intraventriküler teslim 9 kullanmaktadır. Bir kez ventriküle, morfolino-Endo-Porter karışımı hızla damar yoluyla larva yayılır ve hedef önceden imkansız olmuştur dokuları girer. Bu enjeksiyon yöntemi özel dokularda genlerin hedeflenmesi için modifiye edilebilir ve büyük ihtimalle halen gen fonksiyonu inhibe etmek için ters genetik yöntemler eksikliği diğer hayvan modelleri olarak uygulanabilir. Böylece, hemen larva aşamasında genel organı homeostasis ve rejenerasyon sırasında gen işlevini incelemek için geniş bir yelpazede kullanım potansiyeli ile hızlı ve kolay bir yöntem sunar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Intraventriküler enjeksiyon Embriyogenez sırasında gen fonksiyonlarını etkilemeden gelişim veya vücut homeostasis ileriki aşamalarında gen fonksiyon testi için hızlı ve güvenilir bir değerlendirme yöntemi sağlar. Bu tekniğin başarı sağlamak için, bir dört kritik noktaların farkında olmalıdır: iğneden 1) iğne boyutu, 2) kurutma, 3) hacmini minimize ve sedasyon çözeltide 4) minimal maruz kalma süresi. Çok büyük iğneler ventrikül zarar ve aşırı kanamaya neden olurken çok küçük iğ…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) tarafından desteklenen, biz teknik destek için Ayele Tsedeke Taddese teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Company | Catalog Number | Comments/Description | |
| Reagent/Material | |||
| Morpholino with 3´fluorescein tag | Gene Tools Inc. | Customized | More information on www.genetools.com |
| Endo-Porter | Gene Tools Inc. | More information on www.genetools.com | |
| Agarose | Serva | 120623 | For pouring plates to place the fish during injections and imaging |
| Tricane (L-Ethyl-m-amino-benzate-methane sulfonate) | Applichem | For anesthesia | |
| E3 medium (5 mM NaCl; 0.17 mM KCl; 0.33 mM CaCl2; 0.33 mM MgSo4) | For larval husbandry | ||
| Petri Dishes | Sarstedt | 821.472 | For placing the fish during injections and imaging |
| Equipment | |||
| Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments, Inc. | TW100F-3 | For preparing injection needles |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5,242,956,003 | For loading the needle |
| Pasteur Pipettes (3 ml/1 ml) | Brand | 747760/ 74775 | For transfering larva |
| Flaming / Brown needle puller | Sutter | More information on www.sutter.com | |
| Watchmaker (Dumont) Tweezers (size 5) | World Precision Instruments, Inc. | 501985 | To brake the needle before sharpening |
| Dissecting microscope | Olympus, Leica, Zeiss | Varies with the manufacturer | Part of the whole injection setup |
| Fluorescence camera | Olympus, Leica, Zeiss | Varies with the manufacturer | To image the fluorescence after injeciton |
| PicoNozzle kit (microinjector holder) | World Precision Instruments | 5430-12 | For microinjections |
| Pneumatic PicoPump (microinjector) | World Precision Instruments | SYS-PV820 | For microinjections |
Referências
- Gemberlin, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends in Genetics. 29, 611-620 (2013).
- Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish. Nature Protocols. 6, 2011 (1998).
- Skromne, I., Prince, V. E. Current perspectives in zebrafish reverse genetics: moving forward. Developmental Dynamics. 237, 861-882 (2008).
- Zu, Y., et al. TALEN-mediated precise genome modification by homologous recombination in zebrafish. Nature Protocols. 10, 329-332 (2013).
- Bedell, V. M., et al. In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature. 491, 114-118 (2012).
- Kizil, C., IItzsche, A., Kaslin, J., Brand, M. Micromanipulation of gene expression in the adult zebrafish brain using cerebroventricular microinjection of morpholino oligonucleotides. J Vis Exp. , (2013).
- Hyde, D., Godwin, A., Thummel, R. In vivo electroporation of morpholinos into the regenerating adult zebrafish tail fin. J Vis Exp. , (2012).
- Thummel, R., Bailey, T., Hyde, D. In vivo electroporation of morpholinos into the adult zebrafish retina. J Vis Exp. , (2011).
- Rieger, S., Kulkarni, R. P., Darcy, D., Fraser, S. E., Köster, R. W. Quantum dots are powerful multipurose vital labeling agents in zebrafish embryos. Developmental Dynamics. 234, 670-681 (2005).
- Madhavan, M., et al. The role of Pax-6 in lens regeneration. Proceedings of the National Academy of Science U. 103, 14848-14853 (2006).
- Gilmour, D. T., Jessen, J. R., Lin, S. . Zebrafish: a practical approach. 261, 121-143 (2000).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Eisen, J. S., Smith, J. C. Controlling morpholino experiments: don’t stop making antisense. Development. 135, 1735-1743 (2008).
- Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. A primer for morpholino use in zebrafish. Zebrafish. 6, 69-77 (2009).
- Hyatt, T. M., Ekker, S. C. Vectors and techniques for ectopic gene expression in zebrafish. Methods Cell Biol. 59, 117-126 (1999).
- Hans, S., Kaslin, J., Freudenreich, D., Brand, M. Temporally controlled site-specific recombination in zebrafish. PLoS One. 4, (2009).
- Lee, Y., Grill, S., Sanchez, A., Murphy-Ryan, M., Poss, K. D. Fgf signaling instructs position-dependent growth rate during zebrafish fin regeneration. Development. 132, 5173-5183 (2005).
- Liu, S., D, L. S. Zebrafish models for cancer. Annu. Re. Pathol. Mech. Dis. 6, 71-93 (2011).
- Stoick-Cooper, C. L., et al. Distinct Wnt signaling pathways have opposing roles in appendage regeneration. Development. 134, 479-489 (2007).
- Shen, S. P., Aleksic, J., Russell, S. Identifying targets of the Sox domain proteins Dichaete in the Drosophila CNS via targeted expression of dominant negative proteins. BMC Dev. Biol. 13, (2013).
- McNeish, J. D., Scott, W. J., Potter Jr, S. S. Legless, a novel mutation found in PHT1-1 transgenic mice. Science. 241, 837-839 (1988).
- Covarrubias, L., Nishida, Y., Terao, M., D’Eustachio, P., Mintz, B. Cellular DNA rearrangements and early developmental arrest caused by DNA insertion in transgenic mouse embryos. Mol. Cell. Biol. 7, 2243-2247 (1987).
