At modvirke patogen udbredelse, værtsceller reorganisere deres cytoskelet at inddeler bakterier og fremkalde autofagi. Brug af Shigella-infektion af vævskulturceller, vært og patogen determinanter bag denne proces er identificeret og karakteriseret. Brug af zebrafisk modeller af Shigella-infektion, er den rolle, som opdagede molekyler og mekanismer undersøgt in vivo.
Shigella flexneri er et intracellulært patogen, som kan flygte fra phagosomes at nå cytosolen, og polymerisere værten actincytoskelettet at fremme sin motilitet og formidling. Nyt arbejde har vist, at proteiner involveret i actin-baserede motilitet også er knyttet til autophagy, en intracellulær nedbrydning proces afgørende for celle autonom immunitet. Bemærkelsesværdigt, kan værtsceller forhindre actin-baserede motilitet S. flexneri ved afskaerme bakterier indenfor 'septin bure «og målrette dem til autofagi. Disse observationer tyder på, at en mere fuldstændig forståelse af septins, en familie af trådformede GTP-bindende proteiner, vil give ny indsigt i processen med autophagy. Denne rapport beskriver protokoller til at overvåge autofagi-Cytoskeleton interaktioner forårsaget af S. flexneri in vitro under anvendelse vævskulturceller og in vivo ved hjælp af zebrafisk larver. Disse protokoller muliggøre undersøgelse af intracellulære mechanisms, der styrer bakteriel udbredelse på molekylært, cellulært og hele organismen niveau.
Shigella flexneri, en Gram-negativ invasiv enteropatogene bakterie, kan flygte fra phagosomes til cytosolen, og polymerisere værten actincytoskelettet at unddrage cytosoliske immunreaktioner og fremmer intern og intercellulære bevægelse 1,2. På trods af den forståelse af actin-baserede motilitet in vitro 3,4, de mekanismer, der begrænser bakteriel spredning i vivo er ikke fuldstændigt klarlagt. Dette er afgørende for en mere fuldstændig forståelse af medfødte immunitet og vært forsvar.
Septins, en højkonserveret familie af proteiner blandt metazoans er guanosintriphosphat (GTP) -bindende proteiner, der samler ind i hetero-oligomert komplekser og danner polære filamenter, der forbinder med cellemembraner og cytoskelettet 5,6. Nyligt arbejde har opdaget, at inficerede værtsceller kan forhindre Shigella actin baseret motilitet ved afskaerme bakterier målrettet til autophAGY indenfor 'septin bure «, afslører den første cellulære mekanisme, der modvirker actin baseret motilitet 7,8. En bred åben mark efterforskning ligger nu i 'septin biologi og infektion. Septin samling, fremkaldt af en række forskellige patogener (f.eks, Listeria monocytogenes 7,9,10, Mycobacterium marinum 7,8, Candida albicans 11) kan fremstå som et centralt emne i værtsforsvaret 5,12.
Autophagy, en stærkt bevaret intracellulær nedbrydning proces, ses som et centralt element i celle-autonom immunitet på grund af sin evne til at levere cytosoliske bakterier til lysosomet 13,14. Men den rolle af bakteriel autofagi in vivo begrænse eller fremme bakteriereplikation stadig dårligt forstået 15,16. Den zebrafisk (Danio rerio) er dukket op som et hvirveldyr model for studiet af infektioner, fordi det er optisk tilgængeligpå larvestadier når det medfødte immunsystem er allerede funktionelle 17,18. Nyligt arbejde har præget modtagelighed zebrafisk larver til S. flexneri, et paradigme for bakteriel autofagi 15, og har brugt Shigella -zebrafish infektion model til at studere manipulation af autophagy til antibakteriel behandling in vivo 19.
Denne rapport indeholder nye værktøjer og analyser for at studere S. flexneri interaktioner med autofagi og cytoskelettet. I et første skridt, at protokoller overvåge autofagi-cytoskelettet interaktioner beskrives ved hjælp af Shigella-infektion af den humane epitelcellelinie HeLa. For at vurdere den rolle, autofagi-Cytoskeleton interaktioner på Shigella-infektion proces in vitro metoder manipulere autofagi og Cytoskeleton komponenter (ved hjælp af siRNA eller farmakologiske reagenser) er forudsat. Nyt arbejde har vist, at ved hjælp af Shigella-infektion of zebrafisk larver, kan lignende analyser anvendes til at studere celle biologi infektion in vivo. Protokoller til at forberede og inficere zebrafisk larver er detaljeret, og at vurdere værtens respons på Shigella-infektion in vivo, protokoller til at bestemme vært overlevelse og bakteriel byrde af inficeret larver er forudsat. Metoder til at overvåge ansættelsen af septin og autofagi markører til Shigella (ved hjælp af enten fast eller levende zebrafisk larver), og metoder til at teste rollen af disse processer in vivo [hjælp morpholinogrupper oligonukleotider (injiceret i 1-4 celle embryoer) eller farmakologiske reagenser ( tilsættes direkte til zebrafisk badevandet)] er også diskuteret. Dette program forventes arbejde at give indsigt i de mekanismer, der er nødvendige til kontrol af infektion af cytosole værtsresponser.
Ved overvågning autofagi og cytoskelettet in vitro ved anvendelse vævskulturceller, kan de protokoller, der er beskrevet i afsnit 1 og 2 anvendes til en bred vifte af vævskultur celletyper. Desuden følger autophagy (f.eks ATG8 / LC3 + ve autophagosomes) og cytoskelet (f.eks. Actin haler, septin bure) dynamik i realtid i løbet af Shigella-infektion med levende billeddannelse, kan vævsdyrkningsceller transficeres forbigående hjælp GFP-, RFP- eller FFP-mærkede konstruktioner som tidligere beskrevet 7,8. At øge andelen af celler inficeret med Shigella (dvs. generelt ønskeligt for real-time analyse overvejer at Shigella kan invadere 5-30% af HeLa-celler ved 100:. 1 MOI), direkte tilsættes 400 ul af Shigella (OD600 = 0,3 -0.6) til celler i 2 ml MEM (serum-udsultet), og vent mindst 1,5 timer efter infektion tilstrækkelig bakteriel indrejse, flygte fra fagosomet, replikation, AUtophagy anerkendelse og septin bure. Alternativt kan man anvende Shigella M90T AfaI stamme, der udtrykker adhesin AfaE og har meget højere invasion evner i epitelceller i forhold til M90T stamme 28. Af note, M90T AfaI stamme er endnu ikke blevet testet in vivo ved hjælp af zebrafisk. Plader af Shigella kolonier kan opbevares ved 4 ° C i 2-3 dage og anvendes til flere eksperimenter. Men over tid, kolonier af Shigella, der har mistet virulensplasmidet kan også absorbere Congorødt og synes at have bevaret deres virulensplasmid. Af denne grund anbefaler vi at bruge friske bakterielle bestande, når det er muligt.
Ved overvågning af cellebiologi infektion in vivo, protokoller, der er beskrevet i punkt 3 og 4 anvendelse vildtype AB linjen zebrafisk. For at overvåge Shigella -leukocyte interaktioner, kan transgene zebrafisk linjer skal anvendes, f.eks, MPX: GFP eller LYZ: dsRed til visuelize neutrofiler 19,29,30 eller MPEG1: mcherry at visualisere makrofager 19,31. At visualisere autofagi in vivo, kan GFP-Lc3 zebrafisk transgene linje 19,24 bruges som beskrevet i afsnit 3.8.
At forstyrre autofagi in vivo, er den effektive morfolino oligonukleotid dosis skal vurderes eksperimentelt baseret på dens effektivitet til at hæmme afskrift splejsning eller protein oversættelse. Det er tilrådeligt at udføre en titrering eksperiment og bekræfte udtømning ved RT-PCR (for splejs morpholino oligonukleotid) eller ved SDS-PAGE (til translationel morpholino oligonukleotid) 32. RNA-isolering fra zebrafisk embryoner eller larver kan udføres under anvendelse af guanidiniumthiocyanat-phenol-chloroform ekstraktion. At udvinde protein fra zebrafisk larver (8 til 15 larver / rør), mekanisk homogeniseres ved hjælp af pistil i 200 pi lysisbuffer (1 M Tris, 5 M NaCl, 0,5 M EDTA, 0,01% oktylphenol ethylenoxid Kondense og proteasehæmmer). Centrifugerør ved 19.000 xg ved 4 ° C i 15 minutter og overføres supernatanten til et nyt rør. Tilføj Laemmli puffer og opvarmes prøven ved 95 ° C i 15 min. Lysater kan opbevares ved -80 ° C indtil brug, og kan evalueres ved Western blotting som beskrevet i afsnit 2.3.
Zebrafisken er en fremragende model for in vivo-lægemiddel ansøgning. Analyse ved hjælp af morpholino oligonukleotider kan suppleres med etablerede medicin til at manipulere autofagi (fx rapamycin og bafilomycin). Ikke-inficerede og / eller inficerede larver kan behandles med rapamycin (1,5 uM) eller bafilomycin (80 nM) fortyndet i E2 og autophagic flux kan vurderes ved Western blotting som beskrevet i 25,33. Konsekvensen af autofagi manipulation på resultatet af infektion og overlevelse af de inficerede larver kan vurderes som beskrevet i afsnit 3.5.
Ud over at studere værtscelledeterminanter, in vitro og in vivo protokoller kan anvendes til at vurdere bakterielle determinanter, der kræves for autophagy anerkendelse, ved hjælp af bakterielle mutantstammer, der er forskelligt anerkendt af autophagy, f.eks., Shigella ΔicsA (Shigella proteinet ICSA rekrutterer N-WASP og derefter ARP2 / 3 for actin hale og septin bur stiftelse i sit fravær kan der ikke være nogen actin haler, ingen septin bure) og ShigellaΔicsB (Shigella undgår autophagic svar via bakterielle effektor proteiner IcsB, der forhindrer rekruttering af autofagi maskiner til ICSA, i sit fravær Der kan være flere septin bure, mere autofagi) 7,8.
Shigella er ikke en naturlig patogen af zebrafisk og vokser optimalt ved 37 ° C. Hidtil er der dog vist, at virulensfaktorer kræves for Shigella invasion, flygte fra den fagocytiske vacuole og replikation i cytosol kan udtrykkes og er funktionelle i zebrafisk larver ved 28 ° C 19. 28 ° C er den mest almindeligt anvendte temperatur for zebrafisk opdræt og standard temperatur for at sikre normal zebrafisk udvikling 23. Bemærkelsesværdigt er de vigtigste patogene begivenheder, der fører til shigellose i mennesker (dvs. makrofag celledød, invasion og multiplikation i epitelceller, celle-til-celle-spredning, inflammatorisk ødelæggelse af værtens epitel) trofast gengivet i zebrafisk model af Shigella infektion 19.
Autofagi og Cytoskeleton gener ubikvitært udtrykt og har et bredt spektrum af biologiske funktioner. Museforsøg har vist, at knockout af væsentlig autofagi 26 eller septin gener 5 er embryonale dødbringende, og det er sandsynligt, at nogle af disse gener også vil være afgørende for zebrafisk udvikling (selv om dette problem kan reduceres ved, at zebrafisk har flereparalogous gener 33). Hvis ja, er der flere alternativer til at løse dette problem, herunder (i) brug af farmakologiske reagenser til at regulere autofagi og cytoskelettet, (ii) morpholinos kan titreres ned, kan (iii) knockout af gener være konstrueret til kun bestemt celle typer, og / eller (iv) gener involveret i autophagic erkendelse af, at der ikke er afgørende for udvikling af dyr (f.eks., p62) kan målrettes.
Mens zebrafisk er en ideel model for at undersøge autofagi og cytoskelettet under Shigella-infektion, er molekylære værktøjer øjeblikket mangler. Feltet har brug for at generere nye værktøjer og drev celle konkret udtryk for de proteiner af interesse. At banke ned udtryk for autofagi / Cytoskeleton gener er nye morpholinogrupper sekvenser, der kræves, og nye metoder til genom teknik (f.eks Talen, CRISPR / Cas9) kan også anvendes. I mellemtiden, tidligere flere værktøjer genereret for mennesker eller museforsøgkan ligeledes arbejde for zebrafisk.
De intracellulære bakterier S. flexneri har vist sig som en ekstraordinær modelorganisme at tage fat på centrale spørgsmål i biologi, herunder evnen af bakterier til at blive genkendt af immunsystemet 1,2. Værtscellen anvender septins at begrænse motilitet S. flexneri og målrette dem til autophagy, en kritisk komponent i celle autonom immunitet 7,8. Disse observationer tyder på en ny molekylær rammer at studere autofagi og dets evne til at nedbryde cytosoliske bakterier. Et stort problem er nu fuldt ud at dechifrere de underliggende molekylære og cellulære begivenheder, og at validere disse begivenheder analyseret in vitro under bakteriel infektion in vivo anvendelse af relevante dyremodeller. Til dette formål har zebrafisk blevet etableret som en værdifuld ny vært til analyse af S. flexneri infektion 19. Interaktioner mellem bakterier og værtsceller kan afbildes ved høj opløsning, ogzebrafisk modellen skal vise sig nyttig for forståelsen af cellebiologi af Shigella-infektion in vivo. Zebrafisk larver kan bruges til at undersøge, hvilken rolle af bakteriel autofagi i vært forsvar, og arbejde har vist, at der den forstyrrelse af autofagi negativt kan påvirke vært overlevelse som reaktion på Shigella-infektion 19.
De bemærkninger, der genereres fra studiet af Shigella, septin anbringelse i bur og autofagi in vitro ved anvendelse vævsdyrkningsceller og in vivo ved hjælp af zebrafisk larver kan give betydelige fremskridt i forståelsen vært forsvar. De kunne også foreslå udviklingen af nye strategier til bekæmpelse af smitsomme sygdomme.
En kritisk Formålet med rapporten er at give mening for de molekylære og cellulære begivenheder analyseret in vitro (dvs. autofagi, aktin haler, septin anbringelse i bur) under bakteriel infektion in vivo i forbindelse med en entire organisme ved hjælp af zebrafisk larver. Hvis ikke bekendt med zebrafisk biologi og håndtering, kan man henvise til i dybden protokoller for korrekt zebrafisk dyrehold 23 og in vivo analyser af zebrafisk infektion 19,35.
The authors have nothing to disclose.
Arbejdet i SM laboratorium understøttes af en Wellcome Trust Research Karriereudvikling Fellowship [WT097411MA].
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number |
Bafilomycin A1 | Sigma-Aldrich | B1793 |
Blebbistatin | Sigma-Aldrich | B0560 |
Borosilicate glass microcapillars | Harvard Apparatus | 30038 |
Coarse manual manipulator | Narishige | M-152 |
Cytochalasin D | Sigma-Aldrich | C6762 |
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Molecular Probes | D1306 |
Dumont #5 fine tweezers | Fine Science Tools | 11254-20 |
Forchlorfeneuron | Sigma-Aldrich | 32974 |
Goat anti-mouse IgG (H+L) antibody | Molecular Probes | N/A |
Goat ant-rabbit IgG (H+L) antibody | Molecular Probes | N/A |
JetPEI transfection reagent | Polyplus transfection | 101-01N |
Latrunculin B | Sigma-Aldrich | L5288 |
LC3 antibody | Novus Biologicals | NB100-2220 |
Low melting agarose | Promega | V2111 |
MatTek glass bottom dish | MatTek corporation | P35G-1.0-14 |
MEM plus L-alanyl-L-glutamine | GIBCO | 41090028 |
MEM non-essential amino acids solution | GIBCO | 11140-035 |
Microinjector | Narishige | IM-300 |
Micropipette puller device | Sutter Instrument Co., Novato, | P-87 |
Mineral oil | Sigma-Aldrich | P35G-1.0-14 |
Monoclonal anti-tubulin, acetylated antibody | Sigma-Aldrich | T6793 |
Nocodazole | Sigma-Aldrich | M1404 |
N-phenylthiourea | Sigma-Aldrich | P7629 |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 |
Phalloidin | Molecular Probes | A12379 |
Phenol red solution | Sigma-Aldrich | P0290 |
Protease inhibitor cocktail | Roche | 4693116001 |
p62/SQSTM1 antibody | Cliniscience | PM045 |
Rapamycin | Sigma-Aldrich | R8781 |
Sodium pyruvate | GIBCO | 11360039 |
Transfection reagent | Life Technologies | 12252-011 |
Vectashield hard set mounting medium containing DAPI | Vector Laboratories | H-1500 |