从人多能神经嵴前体细胞的无饲养推导干细胞
Summary
Abstract
人类多能干细胞（hPSCs）对研究人类胚胎巨大的发展潜力，在盘模拟人类疾病和移植细胞的疾病或意外事故后再生的应用程序的来源。神经嵴（NC）的细胞是前体种类繁多的成年体细胞，例如从外周神经系统和神经胶质细胞，黑素细胞和间充质细胞的细胞。它们是细胞来研究人类胚胎发育，包括细胞命运规范和迁移方面的重要来源。数控祖细胞进一步分化成终末分化的细胞类型提供模拟人类疾病的体外 ，研究疾病的机理及产生细胞再生医学的可能性。本文介绍了目前在体外分化协议数控细胞从hPSCs推导的适应。这个新的协议需要18天迪菲的rentiation，是无饲养，易于扩展和高重现性之间的人类胚胎干细胞（hESC细胞）线，以及人类诱导多能干细胞（hiPSC）线。旧的和新的协议得到平等的身份数控细胞。
Introduction
人类胚胎干细胞（胚胎干细胞）和人类诱导多能干细胞（hiPSC）显示巨大的潜力，特别是人类疾病对没有良好的动物模型也主要组织提供的调查和今后的治疗。对人类胚胎干细胞/ hiPSC技术应用实例如下：可从人类胚胎干细胞/人iPS细胞生成的再生医学在无限数量1特别感兴趣的细胞。细胞可以从携带特定疾病的患者被制造，以及用于建立体外疾病模型2,3。这种疾病模型，然后可以在追求新的药物化合物4和现有药物的疗效和毒性5的测试被用于大规模药物筛选， 体外疾病模型可以导致新的疾病机制的鉴定。对于人类胚胎干细胞/ IPSC的技术的所有应用中的具体工作是很重要的，良好定义受影响的权益性疾病ð细胞类型。因此，固体和可重复的体外分化协议的可用性是对人类胚胎干细胞/ hiPSC技术的所有应用是至关重要的。协议是可取的，显示最小的变异性，时间牺牲，努力，其中胚胎干细胞/ hiPSC线和不同的研究者难度和成本，以及最大可再现性。
在表皮和神经上皮之间的脊椎动物神经胚形成神经嵴（NC）的细胞出现。它们增殖和迁移广泛地在整个发育中的胚胎和产生子代细胞类型的令人印象深刻的多样性，包括骨/软骨时，颅面骨，感觉神经，雪旺氏细胞，黑素细胞，平滑肌细胞，肠神经元，自主神经元，嗜铬细胞，心脏室间隔细胞，牙齿和肾上腺/甲状腺腺细胞6。因此，NC细胞是一个有吸引力的细胞类型的干细胞领域和对于重要的各种疾病，如先天性巨结肠7，家族性自律神经失调8以及癌症，如神经母细胞瘤9建模。此外，他们提供学习的体外人类胚胎发育的某些方面的可能性。
当前可用的和广泛应用的体外分化方案的数控细胞从人类胚胎干细胞10,11的推导需要长达35天分化的，它涉及到神经诱导的基质饲养细胞如MS5细胞，因而根据定义不明确的条件下进行。虽然它可以是按比例放大，以产生大量的NC细胞，例如需要用于高通量药物筛选4，这是劳动和成本密集型的。此外，它涉及神经花环，可以是难以再现的手动传代并且当它被施加于多种人类胚胎干细胞或hiPSC的因而是受总体变异性，特别是线。这里，示出了NC细胞在18天的协议，它是不含饲养细胞的逐步推导。这个方法是更短，比目前使用的协议更明确。此外，它是在生成的NC细胞不同hiPSC线中非常健壮。重要的是，它表明，数控细胞由双方协议产生出现在的神经花环（以下称为花环-NC或R-NC）的边界。无论是使用的两个协议所产生的细胞形态看起来是相同的，他们表达了同样的数控标记和聚集在一起的微阵列分析。使用新的协议（R-NC）衍生的NC细胞是功能性的，类似于使用旧协议（MS5-R-NC），使得它们可以迁移并进一步分化成神经元衍生的NC细胞。因此，这些细胞可以同时使用与MS5-R-NC细胞。数控细胞从人类胚胎干细胞/ IPSC的推导在R-NC细胞的协议将是对人类胚胎干细胞/ IPSC的技术涉及数控谱系的所有应用程序非常有用。</ P>
Protocol
Representative Results
Discussion
对于R-NC细胞的人类胚胎干细胞从/人iPS细胞成功分化以下考虑应作出。这是至关重要的无菌培养条件下工作在任何时候。特别是，它要定期检测HPSC文化的支原体污染，因为这种污染会阻碍成功的差异化是重要的，但还不能轻易地在HPSC文化视觉检测。在R-NC分化应在90-100％的细胞密度被启动;低细胞密度的影响细胞存活和R-NC分化的效率。重要的是要凭经验验证最佳浓度和一些试剂的批号，特别是KSR支…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
与三机构的干细胞的倡议（斯塔尔基金会），这项工作是由来自瑞士国家科学基金会通过从NYSTEM（C026447 C026446）资助先进的研究人员的研究奖金支持。
Materials
| Regents | company | cataloge number | comments |
| DMEM | Gibco-Life Technologies | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| DMEM/F12 | Gibco-Life Technologies | 11330-032 | |
| Knockout Serum Replacement | Gibco-Life Technologies | 10828-028 | Lot should be tested |
| L-Glutamine | Gibco-Life Technologies | 25030-081 | |
| Penicinlin/Streptomycin | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | |
| MEM minimum essential amino acids solution | Gibco-Life Technologies | 11140-050 | |
| β-Mercaptoethanol | Gibco-Life Technologies | 21985-023 | toxic |
| Recombinant human FGF basic (FGF2) | R&D Systems | 233-FB-001MG/CF | |
| Knockout DMEM | Gibco-Life Technologies | 10829-018 | |
| DMEM/F12 powder | Invitrogen | 12500-096 | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| APO human transferrin | Sigma | T1147 | |
| Human insulin | Sigma | A4034 | |
| Putriscine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| Selenite | Sigma | S5261 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Matrigel matrix | BD Biosciences | 354234 | |
| Poly-L Ornithin hydrobromide | Sigma | P3655 | |
| Mouse Laminin-I | R&D Systems | 3400-010-01 | |
| Fibronectin | BD Biosciences | 356008 | |
| Dispase in Hank's Balanced Salt Solution 5U/ml | Stem Cell Technologies | 7013 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco-Life Technologies | 25300-054 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris-R&D Systems | 1254 | |
| LDN193189 | Stemgent | 04-0074 | |
| SB431542 | Tocris-R&D Systems | 1614 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A4034 | |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD | |
| FGF8 | R&D Systems | 423-F8 | |
| Mouse recombinant sonic hedgehog (SHH) | R&D Systems | 464SH | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| HBSS | Gibco-Life Technologies | 14170-112 | |
| HEPES | Gibco-Life Technologies | 1563-080 | |
| Human recombinant EGF | R&D Systems | 236EG | |
| gelatin (PBS without Mg/Ca) | in house | ||
| Antibodies: | |||
| Anti HNK-1/N-Cam (CD57) mIgM | Sigma | C6680-100TST | lot should be tested |
| Anti-p75 mIgG1 (Nerve Growth factor receptor) | Advanced Targeting Systems | AB-N07 | lot should be tested |
| APC rat anti-mIgM | BD Parmingen | 550676 | lot should be tested |
| AlexaFluor 488 goat anti-mouse IgG1 | Invitrogen | A21121 | lot should be tested |
| Anti Oct4 mIgG2b (used at 1:200 dilution) | Santa Cruz | sc-5279 | lot should be tested |
| Material/Equipment: | |||
| Mouse embryonic fibroblasts (7 million cells/vial) | GlobalStem | GSC-6105M | |
| Cell culture dishes: 10cm and 15 cm plates, centrifuge tubes, FACS tubes, pipetts, pipet tips | |||
| Glass hematocytometer | |||
| Cell culture centrifuge | |||
| Cell culture incubator (CO2, humidity and temperature controlled) | |||
| Cell culture laminar flow hood with embedded microscope | |||
| Cell culture biosafety hood | |||
| Cell sorting machine, i.e. MoFlo | |||
| Inverted microscope | |||
| 1 ml TB syringe 27Gx1/2 | BD Biosciences | 309623 | |
| Cell lifter Polyethylene | Corning Incorporated | 3008 |
Referências
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