Voedingsvrije Afleiding van neurale stamcellen uit humane pluripotente stamcellen
Summary
Abstract
Humane pluripotente stamcellen (hPSCs) hebben een groot potentieel voor het bestuderen van humane embryonale ontwikkeling, voor het modelleren van menselijke ziekten in de schaal en als een bron van te transplanteren cellen voor regeneratieve toepassingen na ziekte of ongeval. Neurale (NC) cellen zijn de voorlopers van een grote verscheidenheid aan volwassen somatische cellen, zoals cellen van het perifere zenuwstelsel en glia, melanocyten en mesenchymale cellen. Ze zijn een waardevolle bron van cellen om aspecten van de menselijke embryonale ontwikkeling, met inbegrip van lot van de cel specificatie en migratie te bestuderen. Verdere differentiatie van NC progenitorcellen in terminaal gedifferentieerde celtypes biedt de mogelijkheid om menselijke ziekten te modelleren vitro onderzoeken ziektemechanismen en het genereren van cellen voor regeneratieve geneeskunde. Dit artikel presenteert de aanpassing van een op dit moment beschikbaar in vitro differentiatie protocol voor de afleiding van NC cellen uit hPSCs. Dit nieuwe protocol vereist 18 dagen van verschilrentiation, is-feeder gratis, eenvoudig schaalbaar en zeer reproduceerbaar onder menselijke embryonale stamcellen (hESC) lijnen alsook humane geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC) lijnen. Zowel oude als nieuwe protocollen opleveren NC cellen van gelijke identiteit.
Introduction
Menselijke embryonale stamcellen (hESC) en humane geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC) hebben laten zien een enorm potentieel, met name voor het onderzoek en de toekomstige behandeling van menselijke ziekten waarvoor geen goede diermodellen noch primaire weefsels beschikbaar zijn. Toepassingsvoorbeelden voor de hESC / hiPSC technologie zijn de volgende: Cellen van bijzonder belang kunnen worden gegenereerd uit hESC / hiPSCs voor regeneratieve geneeskunde aan onbeperkte hoeveelheid 1. Cellen kunnen worden verkregen uit patiënten die een bepaalde ziekte en dienen om ten in vitro ziektemodellen 2,3. Dergelijke ziekte modellen kunnen vervolgens worden gebruikt voor grootschalige screening van geneesmiddelen in de zoektocht naar nieuwe geneesmiddelen verbindingen 4, alsmede het testen van bestaande geneesmiddelen voor de werkzaamheid en toxiciteit 5. In vitro modellen ziekte kan leiden tot de identificatie van nieuwe ziektemechanismen. Voor alle toepassingen van hESC / iPSC technologie is het belangrijk om met specifieke, goed definiërend celtypen betrokken bij de ziekte van belang. Aldus, de beschikbaarheid van vaste en reproduceerbare in vitro differentiatie protocollen is cruciaal voor alle toepassingen van de hESC / hiPSC technologie. Protocollen zijn gewenst die minimale variabiliteit tijd kosten, inspanning, moeite en kosten en maximale reproduceerbaarheid onder hESC / hiPSC lijnen en andere onderzoekers tonen.
Neurale lijst (NC) cellen ontstaan tijdens gewervelde neurulatie tussen de opperhuid en de neurale epitheel. Ze prolifereren en migreren veel door het ontwikkelende embryo en aanleiding geven tot een indrukwekkende verscheidenheid nakomelingen celtypen, waaronder bot / kraakbeen, het craniofaciale skelet, sensorische zenuwen, Schwann cellen, melanocyten, gladde spiercellen, enterische neuronen, autonome neuronen, chromaffinecellen , cardiale septum cellen, tanden en bijnier / schildklier kliercellen 6. Aldus NC cellen een aantrekkelijk celtype voor het veld stamcel en belangrijk voor demodellering van een verscheidenheid van ziekten, zoals de ziekte van Hirschsprung 7, familiale Dysautonomia 8 en kanker zoals neuroblastoma 9. Bovendien bieden zij de mogelijkheid aspecten van menselijke embryonale ontwikkeling in vitro bestuderen.
De momenteel beschikbare en schaal toegepast in vitro differentiatie protocol voor de afleiding van NC cellen van hESCs 10,11 is maximaal 35 dagen van differentiatie en het gaat neurale inductie stromale feeder-cellen zoals MS5 cellen en derhalve uitgevoerd onder slecht gedefinieerde omstandigheden. Hoewel het kan worden opgeschaald tot grote hoeveelheden NC te genereren, zoals vereist voor hoge-doorvoer screening van geneesmiddelen 4, dit is arbeidsintensief en kostbaar. Bovendien vereist handmatige passage van neurale rozetten, die moeilijk te reproduceren zijn en is dus onderhevig aan totale variabiliteit, met name wanneer het wordt toegepast op een grote verscheidenheid van hESC of hiPSClijnen. Hier wordt de stapsgewijze afleiding van NC cellen per 18 dagen protocol dat zonder voedercellen weergegeven. Deze methode is korter en gedefinieerd dan de momenteel gebruikte protocol. Bovendien is zeer robuust genereren NC cellen tussen verschillende hiPSC lijnen. Belangrijk is, wordt aangetoond dat de NC-cellen leverde door beide protocollen ontstaan op de grens van neurale rozetten (hierna genoemd rozet-NC of R-NC). De cellen afgeleid met behulp van een van de twee protocollen kijken morfologisch identiek, drukken zij dezelfde NC markers en cluster samen in microarray analyse. NC cellen afgeleid met behulp van het nieuwe protocol (R-NC) zijn functioneel, vergelijkbaar met NC cellen afgeleid met behulp van het oude protocol (MS5-R-NC), zodanig dat ze kunnen migreren en verder differentiëren tot neuronen. Derhalve kunnen de cellen gelijktijdig worden gebruikt met de MS5-R-NC cellen. De R-NC cel protocol voor de afleiding van NC cellen van hESC / IPSC nuttig zal zijn voor alle toepassingen van de hESC / IPSC technologie waarbij het NC geslacht zijn. </ P>
Protocol
Representative Results
Discussion
Voor de succesvolle differentiatie van R-NC cellen van hESC / hiPSCs de volgende overwegingen worden gemaakt. Het is cruciaal om te werken onder steriele kweek omstandigheden bewaard. In het bijzonder is het belangrijk HPSC culturen mycoplasmabesmetting testen geregeld, aangezien deze verontreiniging Succesvolle differentiatie belemmert, maar niet gemakkelijk visueel in HPSC kweken gedetecteerd. De R-NC differentiatie moeten bij 90-100% celdichtheid worden gestart; lagere celdichtheid beïnvloedt overleving van de cel e…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door een beurs voor gevorderde onderzoekers van de Zwitserse National Science Foundation en door subsidies van NYSTEM (C026446, C026447) en de Tri-institutionele stamcel initiatief (Starr Foundation).
Materials
| Regents | company | cataloge number | comments |
| DMEM | Gibco-Life Technologies | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| DMEM/F12 | Gibco-Life Technologies | 11330-032 | |
| Knockout Serum Replacement | Gibco-Life Technologies | 10828-028 | Lot should be tested |
| L-Glutamine | Gibco-Life Technologies | 25030-081 | |
| Penicinlin/Streptomycin | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | |
| MEM minimum essential amino acids solution | Gibco-Life Technologies | 11140-050 | |
| β-Mercaptoethanol | Gibco-Life Technologies | 21985-023 | toxic |
| Recombinant human FGF basic (FGF2) | R&D Systems | 233-FB-001MG/CF | |
| Knockout DMEM | Gibco-Life Technologies | 10829-018 | |
| DMEM/F12 powder | Invitrogen | 12500-096 | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| APO human transferrin | Sigma | T1147 | |
| Human insulin | Sigma | A4034 | |
| Putriscine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| Selenite | Sigma | S5261 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Matrigel matrix | BD Biosciences | 354234 | |
| Poly-L Ornithin hydrobromide | Sigma | P3655 | |
| Mouse Laminin-I | R&D Systems | 3400-010-01 | |
| Fibronectin | BD Biosciences | 356008 | |
| Dispase in Hank's Balanced Salt Solution 5U/ml | Stem Cell Technologies | 7013 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco-Life Technologies | 25300-054 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris-R&D Systems | 1254 | |
| LDN193189 | Stemgent | 04-0074 | |
| SB431542 | Tocris-R&D Systems | 1614 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A4034 | |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD | |
| FGF8 | R&D Systems | 423-F8 | |
| Mouse recombinant sonic hedgehog (SHH) | R&D Systems | 464SH | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| HBSS | Gibco-Life Technologies | 14170-112 | |
| HEPES | Gibco-Life Technologies | 1563-080 | |
| Human recombinant EGF | R&D Systems | 236EG | |
| gelatin (PBS without Mg/Ca) | in house | ||
| Antibodies: | |||
| Anti HNK-1/N-Cam (CD57) mIgM | Sigma | C6680-100TST | lot should be tested |
| Anti-p75 mIgG1 (Nerve Growth factor receptor) | Advanced Targeting Systems | AB-N07 | lot should be tested |
| APC rat anti-mIgM | BD Parmingen | 550676 | lot should be tested |
| AlexaFluor 488 goat anti-mouse IgG1 | Invitrogen | A21121 | lot should be tested |
| Anti Oct4 mIgG2b (used at 1:200 dilution) | Santa Cruz | sc-5279 | lot should be tested |
| Material/Equipment: | |||
| Mouse embryonic fibroblasts (7 million cells/vial) | GlobalStem | GSC-6105M | |
| Cell culture dishes: 10cm and 15 cm plates, centrifuge tubes, FACS tubes, pipetts, pipet tips | |||
| Glass hematocytometer | |||
| Cell culture centrifuge | |||
| Cell culture incubator (CO2, humidity and temperature controlled) | |||
| Cell culture laminar flow hood with embedded microscope | |||
| Cell culture biosafety hood | |||
| Cell sorting machine, i.e. MoFlo | |||
| Inverted microscope | |||
| 1 ml TB syringe 27Gx1/2 | BD Biosciences | 309623 | |
| Cell lifter Polyethylene | Corning Incorporated | 3008 |
Referências
- Lee, G., Studer, L. Induced pluripotent stem cell technology for the study of human disease. Nat Methods. 7, 25-27 (2010).
- Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461, 402-406 (2009).
- Ebert, A. D., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457, 277-280 (2009).
- Lee, G., et al. Large-scale screening using familial dysautonomia induced pluripotent stem cells identifies compounds that rescue IKBKAP expression. Nat Biotechnol. 30, 1244-1248 (2012).
- Zimmer, B., et al. Evaluation of developmental toxicants and signaling pathways in a functional test based on the migration of human neural crest cells. Environ Health Perspect. 120, 1116-1122 (2012).
- Dupin, E., Sommer, L. Neural crest progenitors and stem cells: from early development to adulthood. Dev Biol. 366, 83-95 (2012).
- McKeown, S. J., Stamp, L., Hao, M. M., Young, H. M. Hirschsprung disease: a developmental disorder of the enteric nervous system. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2, 113-129 (2013).
- Slaugenhaupt, S. A., et al. Tissue-specific expression of a splicing mutation in the IKBKAP gene causes familial dysautonomia. Am J Hum Genet. 68, 598-605 (2001).
- Cheung, N. K., Dyer, M. A. Neuroblastoma: developmental biology, cancer genomics and immunotherapy. Nat Rev Cancer. 13, 397-411 (2013).
- Lee, G., et al. Isolation and directed differentiation of neural crest stem cells derived from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25, 1468-1475 (2007).
- Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Derivation of neural crest cells from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 5, 688-701 (2010).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
- Itoh, K., et al. Reproducible establishment of hemopoietic supportive stromal cell lines from murine bone marrow. Exp Hematol. 17, 145-153 (1989).
- Barberi, T., et al. Neural subtype specification of fertilization and nuclear transfer embryonic stem cells and application in parkinsonian mice. Nat Biotechnol. 21, 1200-1207 (2003).
- Elkabetz, Y., et al. Human ES cell-derived neural rosettes reveal a functionally distinct early neural stem cell stage. Genes Dev. 22, 152-165 (2008).
- Mica, Y., Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Modeling neural crest induction, melanocyte specification, and disease-related pigmentation defects in hESCs and patient-specific iPSCs. Cell Rep. 3, 1140-1152 (2013).
- Molofsky, A. V., et al. Bmi-1 dependence distinguishes neural stem cell self-renewal from progenitor proliferation. Nature. 425, 962-967 (2003).
