גזירה ללא מזין של תאים עצביים קרסט אב קדמון מפלוריפוטנטיים אדם בתאי גזע
Summary
Abstract
תאים אנושיים גזע pluripotent (hPSCs) יש פוטנציאל גדול ללימוד התפתחות עוברית אנושית, לדוגמנות מחלות אנושיות בצלחת וכמקור לתאים להשתלה, שיישומי משובי לאחר מחלה או תאונה. תאים עצביים לפסגה (NC) הם סימנים מקדימים למגוון גדול של תאים סומטיים בוגרים, כגון תאים ממערכת העצבים ההיקפית וגליה, מלנוציטים ותאי mesenchymal. הם מקור חשוב של תאים ללמוד היבטים של התפתחות עוברית אנושית, כוללים מפרט גורל תא והגירה. הבחנה נוספת של תאי אב NC לסוגי הבדיל סופני סלולריים מציעה את האפשרות למודל מחלות אנושיות במבחנה, לחקור מנגנוני מחלה וליצור תאים לרפואת רגנרטיבית. מאמר זה מציג את העיבוד של במבחנה פרוטוקול בידול זמין כרגע להפקת תאי NC מhPSCs. פרוטוקול חדש זה דורש 18 ימי differentiation, כלומר, להרחבה בקלות ושחזור מאוד בין תאי גזע עובריים אנושיים קווים (hESC), כמו גם בתאי גזע pluripotent אדם הנגרם על קווים (hiPSC) ללא מזין. שני פרוטוקולים הישנים וחדשים יניבו תאי NC של זהות שווה.
Introduction
תאי גזע עובריים אנושיים (hESC) ותאי גזע pluripotent מושרה (hiPSC) הראו פוטנציאל עצום, בפרט לבירור ולטיפול עתידי במחלות בבני אדם שלמודלים של בעלי חיים לא טובים ולא רקמות עיקריות זמינות. דוגמאות יישום לטכנולוגית hESC / hiPSC הן כדלקמן: תאים בעלי עניין מיוחד ניתן להפיק מן hESC / hiPSCs לרפואת רגנרטיבית בכמות בלתי מוגבלת 1. יכולים להיות מיוצרים בתאים של חולים שנשאו מחלה ספציפית ושימשו להקמה במודלי מחלה מבחנה 2,3. מודלים מחלה כזו אז יכול להיות מועסק להקרנת סמים בקנה מידה גדולה בחיפוש אחר תרכובות תרופה חדשות 4, כמו גם בדיקות של תרופות קיימות ליעילות ורעיל 5. במבחנה מודלים מחלה יכולים להוביל לזיהוי מנגנוני מחלה רומן. עבור כל היישומים של טכנולוגית hESC / iPSC חשוב לעבוד עם מסוים, גם להגדיר-סוגי תאי ד המושפעים במחלה של עניין. לפיכך, על זמינותו של במבחנה פרוטוקולי בידול מוצקים ושחזור היא חיונית עבור כל היישומים של טכנולוגית hESC / hiPSC. פרוטוקולים רצויים שמראה השתנות מינימאלית, הוצאות זמן, מאמץ, קושי ועלות, כמו גם שחזור מקסימאלי בין קווי hESC / hiPSC וחוקרים שונים.
תאי רכס עצבי (NC) לצוץ במהלך neurulation חוליות בין האפידרמיס ואפיתל העצבי. הם להתרבות ולהעביר באופן נרחב ברחבי העובר המתפתח ולהצמיח מגוון מרשים של סוגי תאי צאצאים, כוללים עצם / סחוס, שלד craniofacial, עצבים חושיים, תאי שוואן, מלנוציטים, תאי שריר חלק, תאי עצב enteric, הנוירונים אוטונומיים, תאי chromaffin , תאי מחיצת לב, שיניים ובלוטות יותרת הכליה תאים / בלוטת התריס 6. לכן, תאי NC הם סוג תא אטרקטיבי עבור שדה תאי גזע וחשוב עבורמודלים של מגוון רחב של מחלות, כגון מחלת הירשפרונג 7, המשפחתי דיסאוטונומיה 8, כמו גם סוגי סרטן כגון נוירובלסטומה 9. יתר על כן, הם מציעים את האפשרות ללמוד היבטים של התפתחות עוברית אנושית במבחנה.
זמין כרגע ומיושמים באופן נרחב בפרוטוקול בידול מבחנה להפקת תאי NC מhESCs 10,11 דורש עד 35 ימים של בידול וזה כרוך באינדוקציה עצבית בתאים מזינים סטרומה כגון תאי MS5 ומתבצע כך בתנאים מוגדרים היטב. למרות שזה יכול להיות עד בקנה מידה כדי לייצר כמויות גדולות של תאי NC, למשל נדרש להקרנת סמים תפוקה גבוהה 4, זה עבודה ועלות אינטנסיבית. יתר על כן, היא כרוכה passaging הידני של רוזטות העצבית, שיכול להיות קשה ללהתרבות ולכן כפופה לשונות הכוללות, בפרט כאשר הוא מוחל על מגוון גדול של hESC או hiPSCקווים. הנה, את הגזירה בשלבים של תאי NC בפרוטוקול 18 יום שהוא ללא תאים מזינים מוצגת. שיטה זו היא קצרה יותר ומוגדרת יותר מאשר הפרוטוקול המשמש כיום. יתר על כן, זה מאוד חזק ביצירת תאי NC בין קווי hiPSC שונים. חשוב מכך, הוא הראה כי תאי NC הניבו ידי שני הפרוטוקולים מופיעים בגבול של רוזטות העצבית (שושנה-NC מכונה להלן או R-NC). התאים שמקורם באחת משני הפרוטוקולים נראים מורפולוגית זהים, הם מבטאים את אותו סמני NC ולהתקבץ יחדיו בניתוח microarray. תאי NC נגזרים באמצעות הפרוטוקול החדש (R-NC) הם פונקציונליים, בדומה לתאי NC נגזרים באמצעות הפרוטוקול הישן (MS5-R-NC) באופן שהם יכולים להעביר ועוד להתמיין לתאי עצב. לכן, ניתן להשתמש בתאים במקביל לתאי MS5-R-NC. פרוטוקול תא R-NC לגזירה של תאי NC מhESC / iPSC יהיה שימושי עבור כל היישומים של טכנולוגית hESC / iPSC מעורב שושלת NC. </ P>
Protocol
Representative Results
Discussion
לבידול המוצלח של תאי R-NC מhESC / hiPSCs השיקולים הבאים צריכים להיעשות. זה קריטי כדי לעבוד בתנאים סטריליים תרבות בכל העת. בפרט, חשוב לבחון תרבויות hPSC לזיהום Mycoplasma באופן קבוע, שכן זיהום זה יפריע בידול מוצלח, אבל לא יכול בקלות להיות מזוהה מבחינה ויזואלית בתרבויות hPSC. בידול R-NC צר…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענק לחוקרים מתקדמים מהשויצרי הקרן הלאומית למדע ובאמצעות מענקים מNYSTEM (C026446; C026447) והיוזמה Tri-המוסדית בתאי גזע (סטאר קרן).
Materials
| Regents | company | cataloge number | comments |
| DMEM | Gibco-Life Technologies | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| DMEM/F12 | Gibco-Life Technologies | 11330-032 | |
| Knockout Serum Replacement | Gibco-Life Technologies | 10828-028 | Lot should be tested |
| L-Glutamine | Gibco-Life Technologies | 25030-081 | |
| Penicinlin/Streptomycin | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | |
| MEM minimum essential amino acids solution | Gibco-Life Technologies | 11140-050 | |
| β-Mercaptoethanol | Gibco-Life Technologies | 21985-023 | toxic |
| Recombinant human FGF basic (FGF2) | R&D Systems | 233-FB-001MG/CF | |
| Knockout DMEM | Gibco-Life Technologies | 10829-018 | |
| DMEM/F12 powder | Invitrogen | 12500-096 | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| APO human transferrin | Sigma | T1147 | |
| Human insulin | Sigma | A4034 | |
| Putriscine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| Selenite | Sigma | S5261 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Matrigel matrix | BD Biosciences | 354234 | |
| Poly-L Ornithin hydrobromide | Sigma | P3655 | |
| Mouse Laminin-I | R&D Systems | 3400-010-01 | |
| Fibronectin | BD Biosciences | 356008 | |
| Dispase in Hank's Balanced Salt Solution 5U/ml | Stem Cell Technologies | 7013 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco-Life Technologies | 25300-054 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris-R&D Systems | 1254 | |
| LDN193189 | Stemgent | 04-0074 | |
| SB431542 | Tocris-R&D Systems | 1614 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A4034 | |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD | |
| FGF8 | R&D Systems | 423-F8 | |
| Mouse recombinant sonic hedgehog (SHH) | R&D Systems | 464SH | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| HBSS | Gibco-Life Technologies | 14170-112 | |
| HEPES | Gibco-Life Technologies | 1563-080 | |
| Human recombinant EGF | R&D Systems | 236EG | |
| gelatin (PBS without Mg/Ca) | in house | ||
| Antibodies: | |||
| Anti HNK-1/N-Cam (CD57) mIgM | Sigma | C6680-100TST | lot should be tested |
| Anti-p75 mIgG1 (Nerve Growth factor receptor) | Advanced Targeting Systems | AB-N07 | lot should be tested |
| APC rat anti-mIgM | BD Parmingen | 550676 | lot should be tested |
| AlexaFluor 488 goat anti-mouse IgG1 | Invitrogen | A21121 | lot should be tested |
| Anti Oct4 mIgG2b (used at 1:200 dilution) | Santa Cruz | sc-5279 | lot should be tested |
| Material/Equipment: | |||
| Mouse embryonic fibroblasts (7 million cells/vial) | GlobalStem | GSC-6105M | |
| Cell culture dishes: 10cm and 15 cm plates, centrifuge tubes, FACS tubes, pipetts, pipet tips | |||
| Glass hematocytometer | |||
| Cell culture centrifuge | |||
| Cell culture incubator (CO2, humidity and temperature controlled) | |||
| Cell culture laminar flow hood with embedded microscope | |||
| Cell culture biosafety hood | |||
| Cell sorting machine, i.e. MoFlo | |||
| Inverted microscope | |||
| 1 ml TB syringe 27Gx1/2 | BD Biosciences | 309623 | |
| Cell lifter Polyethylene | Corning Incorporated | 3008 |
Referências
- Lee, G., Studer, L. Induced pluripotent stem cell technology for the study of human disease. Nat Methods. 7, 25-27 (2010).
- Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461, 402-406 (2009).
- Ebert, A. D., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457, 277-280 (2009).
- Lee, G., et al. Large-scale screening using familial dysautonomia induced pluripotent stem cells identifies compounds that rescue IKBKAP expression. Nat Biotechnol. 30, 1244-1248 (2012).
- Zimmer, B., et al. Evaluation of developmental toxicants and signaling pathways in a functional test based on the migration of human neural crest cells. Environ Health Perspect. 120, 1116-1122 (2012).
- Dupin, E., Sommer, L. Neural crest progenitors and stem cells: from early development to adulthood. Dev Biol. 366, 83-95 (2012).
- McKeown, S. J., Stamp, L., Hao, M. M., Young, H. M. Hirschsprung disease: a developmental disorder of the enteric nervous system. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2, 113-129 (2013).
- Slaugenhaupt, S. A., et al. Tissue-specific expression of a splicing mutation in the IKBKAP gene causes familial dysautonomia. Am J Hum Genet. 68, 598-605 (2001).
- Cheung, N. K., Dyer, M. A. Neuroblastoma: developmental biology, cancer genomics and immunotherapy. Nat Rev Cancer. 13, 397-411 (2013).
- Lee, G., et al. Isolation and directed differentiation of neural crest stem cells derived from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25, 1468-1475 (2007).
- Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Derivation of neural crest cells from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 5, 688-701 (2010).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
- Itoh, K., et al. Reproducible establishment of hemopoietic supportive stromal cell lines from murine bone marrow. Exp Hematol. 17, 145-153 (1989).
- Barberi, T., et al. Neural subtype specification of fertilization and nuclear transfer embryonic stem cells and application in parkinsonian mice. Nat Biotechnol. 21, 1200-1207 (2003).
- Elkabetz, Y., et al. Human ES cell-derived neural rosettes reveal a functionally distinct early neural stem cell stage. Genes Dev. 22, 152-165 (2008).
- Mica, Y., Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Modeling neural crest induction, melanocyte specification, and disease-related pigmentation defects in hESCs and patient-specific iPSCs. Cell Rep. 3, 1140-1152 (2013).
- Molofsky, A. V., et al. Bmi-1 dependence distinguishes neural stem cell self-renewal from progenitor proliferation. Nature. 425, 962-967 (2003).
