मानव pluripotent से तंत्रिका शिखा पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के फीडर से मुक्त व्युत्पत्ति स्टेम सेल
Summary
Abstract
मानव pluripotent स्टेम सेल (hPSCs) पकवान में मानव रोगों के लिए मॉडलिंग और बीमारी या दुर्घटना के बाद पुनर्योजी अनुप्रयोगों के लिए transplantable कोशिकाओं के एक स्रोत के रूप में, मानव भ्रूण के विकास के अध्ययन के लिए काफी संभावना है. तंत्रिका शिखा (नेकां) कोशिकाओं परिधीय तंत्रिका तंत्र और glia, melanocytes और mesenchymal कोशिकाओं से कोशिकाओं के रूप में वयस्क दैहिक कोशिकाओं की एक विशाल विविधता के लिए व्यापारियों रहे हैं. वे सेल भाग्य विनिर्देश और प्रवास सहित मानव भ्रूण के विकास के पहलुओं का अध्ययन करने के लिए कोशिकाओं का एक महत्वपूर्ण स्रोत हैं. टर्मिनली विभेदित प्रकार की कोशिकाओं में नेकां पूर्वज कोशिकाओं के आगे भेदभाव, इन विट्रो में मानव रोगों मॉडल रोग तंत्र की जांच और पुनर्योजी चिकित्सा के लिए कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए संभावना प्रदान करता है. यह लेख hPSCs से नेकां कोशिकाओं की व्युत्पत्ति के लिए एक वर्तमान में उपलब्ध इन विट्रो भेदभाव प्रोटोकॉल का अनुकूलन प्रस्तुत करता है. इस नए प्रोटोकॉल diffe की 18 दिनों की आवश्यकताrentiation, फीडर मुक्त मानव भ्रूण स्टेम सेल (hESC) लाइनों के साथ ही मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (hiPSC) लाइनों के बीच आसानी से स्केलेबल और अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है. दोनों पुराने और नए प्रोटोकॉल बराबर पहचान की नेकां कोशिकाओं उपज.
Introduction
मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (hESC) और मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (hiPSC) अच्छा पशु मॉडल और न ही प्राथमिक ऊतकों न तो उपलब्ध हैं, जिसके लिए मानव रोगों की जांच और भविष्य के इलाज के लिए विशेष रूप से, अपार क्षमता दिखाई है. HESC / hiPSC प्रौद्योगिकी के लिए आवेदन उदाहरण निम्नलिखित हैं: विशेष ब्याज की कोशिकाओं असीमित मात्रा 1 पर पुनर्योजी चिकित्सा के लिए hESC / hiPSCs से उत्पन्न हो सकता है. कोशिकाओं एक विशिष्ट रोग पेट के रोगियों से उत्पादन किया है और इन विट्रो रोग मॉडल 2,3 में स्थापित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस तरह के रोग मॉडल तो नई दवा यौगिकों 4 के लिए खोज के रूप में अच्छी तरह से प्रभावकारिता और विषाक्तता 5 के लिए मौजूदा दवाओं के परीक्षण में बड़े पैमाने पर दवा स्क्रीनिंग के लिए नियोजित किया जा सकता. इन विट्रो रोग मॉडल उपन्यास रोग तंत्र की पहचान करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. HESC / iPSC प्रौद्योगिकी के सभी अनुप्रयोगों के लिए यह विशेष के साथ काम करने के लिए महत्वपूर्ण है, अच्छी तरह से परिभाषितब्याज की बीमारी से प्रभावित डी प्रकार की कोशिकाओं. इस प्रकार, ठोस और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने के लिए इन विट्रो भेदभाव प्रोटोकॉल की उपलब्धता hESC / hiPSC प्रौद्योगिकी के सभी अनुप्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण है. प्रोटोकॉल hESC / hiPSC लाइनों और विभिन्न शोधकर्ताओं के बीच कम से कम परिवर्तनशीलता, समय खर्च, प्रयास, कठिनाई और लागत के साथ ही अधिक से अधिक reproducibility दिखा कि वांछित हैं.
तंत्रिका शिखा (नेकां) कोशिकाओं epidermis और तंत्रिका उपकला के बीच हड्डीवाला neurulation के दौरान उभरने. वे पैदा करना और विकासशील भ्रूण भर में बड़े पैमाने पर विस्थापित और हड्डी / उपास्थि, craniofacial कंकाल, संवेदी तंत्रिकाओं, श्वान कोशिकाओं, melanocytes, चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं, आंतों का न्यूरॉन्स, स्वायत्त न्यूरॉन्स, क्रोमाफिन कोशिकाओं सहित, संतान प्रकार की कोशिकाओं के एक प्रभावशाली विविधता को जन्म दे , हृदय पट कोशिकाओं, दांत और अधिवृक्क / थायराइड ग्रंथियों की कोशिकाओं 6. इस प्रकार, नेकां कोशिकाओं को एक आकर्षक सेल स्टेम सेल क्षेत्र के लिए प्रकार और के लिए महत्वपूर्ण हैंऐसे हिर्स्चस्प्रुंग रोग 7, पारिवारिक दुःस्वायत्तता 8 के साथ ही इस तरह के neuroblastoma 9 के रूप में कैंसर जैसे रोगों की एक किस्म की मॉडलिंग. इसके अलावा, वे इन विट्रो में मानव भ्रूण के विकास के पहलुओं का अध्ययन करने के लिए संभावना प्रदान करते हैं.
वर्तमान में उपलब्ध है और व्यापक रूप से hESCs 10,11 से नेकां कोशिकाओं की व्युत्पत्ति के लिए इन विट्रो भेदभाव प्रोटोकॉल में लागू भेदभाव के 35 दिनों के लिए आने की आवश्यकता है और यह इस तरह के MS5 कोशिकाओं के रूप में stromal फीडर कोशिकाओं पर तंत्रिका प्रेरण शामिल है और इस तरह खराब परिभाषित शर्तों के तहत किया जाता है. यह नेकां कोशिकाओं की बड़ी मात्रा में उत्पन्न करने के लिए बढ़ाया ऊपर जा सकता है, उच्च throughput दवा स्क्रीनिंग 4 के लिए आवश्यक उदाहरण के लिए, यह श्रम और लागत गहन है. इसके अलावा, यह पुन: पेश करने के लिए मुश्किल हो सकता है जो तंत्रिका rosettes, का मार्गदर्शन passaging शामिल है और यह hESC या hiPSC की एक विशाल विविधता के लिए लागू किया जाता है जब इस प्रकार विशेष रूप से समग्र परिवर्तनशीलता के अधीन हैलाइनों. इधर, फीडर कोशिकाओं से मुक्त है कि एक 18 दिन के प्रोटोकॉल में नेकां कोशिकाओं की stepwise व्युत्पत्ति दिखाया गया है. इस विधि वर्तमान में इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल की तुलना में कम और अधिक परिभाषित किया गया है. इसके अलावा, यह अलग hiPSC लाइनों के बीच नेकां कोशिकाओं को पैदा करने में बहुत मजबूत है. महत्वपूर्ण बात है, यह दोनों प्रोटोकॉल द्वारा झुकेंगे नेकां कोशिकाओं तंत्रिका rosettes (इसके बाद करार दिया थाली नेकां या आर नेकां) की सीमा पर उभरने दिखाया गया है. दो प्रोटोकॉल का उपयोग कर या तो व्युत्पन्न कोशिकाओं वे एक ही नेकां मार्करों व्यक्त और माइक्रोएरे विश्लेषण में एक साथ क्लस्टर, आकृति विज्ञान के समान लग रही है. नए प्रोटोकॉल (आर नेकां) का उपयोग कर ली गई नेकां कोशिकाओं वे विस्थापित और आगे न्यूरॉन्स में अंतर कर सकते हैं कि इस तरह के पुराने प्रोटोकॉल (MS5 आर नेकां) का उपयोग कर ली गई नेकां कोशिकाओं के समान कार्य कर रहे हैं. इसलिए, कोशिकाओं MS5 आर नेकां कोशिकाओं के साथ समवर्ती इस्तेमाल किया जा सकता है. HESC / iPSC से नेकां कोशिकाओं की व्युत्पत्ति के लिए R-नेकां सेल प्रोटोकॉल नेकां वंश से जुड़े hESC / iPSC प्रौद्योगिकी के सभी अनुप्रयोगों के लिए उपयोगी हो जाएगा. </ P>
Protocol
Representative Results
Discussion
HESC / hiPSCs से आर नेकां कोशिकाओं के सफल भेदभाव के लिए निम्न विचार किया जाना चाहिए. यह हर समय बाँझ संस्कृति शर्तों के तहत काम करने के लिए महत्वपूर्ण है. विशेष रूप से, यह इस संक्रमण सफल भेदभाव बाधा के बाद से नियमि…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
और त्रिकोणीय संस्थागत स्टेम सेल पहल (स्टार फाउंडेशन) है, यह काम स्विस राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन की ओर से और NYSTEM (C026447 C026446) से अनुदान के माध्यम से उन्नत शोधकर्ताओं के लिए एक फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Regents | company | cataloge number | comments |
| DMEM | Gibco-Life Technologies | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| DMEM/F12 | Gibco-Life Technologies | 11330-032 | |
| Knockout Serum Replacement | Gibco-Life Technologies | 10828-028 | Lot should be tested |
| L-Glutamine | Gibco-Life Technologies | 25030-081 | |
| Penicinlin/Streptomycin | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | |
| MEM minimum essential amino acids solution | Gibco-Life Technologies | 11140-050 | |
| β-Mercaptoethanol | Gibco-Life Technologies | 21985-023 | toxic |
| Recombinant human FGF basic (FGF2) | R&D Systems | 233-FB-001MG/CF | |
| Knockout DMEM | Gibco-Life Technologies | 10829-018 | |
| DMEM/F12 powder | Invitrogen | 12500-096 | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| APO human transferrin | Sigma | T1147 | |
| Human insulin | Sigma | A4034 | |
| Putriscine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| Selenite | Sigma | S5261 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Matrigel matrix | BD Biosciences | 354234 | |
| Poly-L Ornithin hydrobromide | Sigma | P3655 | |
| Mouse Laminin-I | R&D Systems | 3400-010-01 | |
| Fibronectin | BD Biosciences | 356008 | |
| Dispase in Hank's Balanced Salt Solution 5U/ml | Stem Cell Technologies | 7013 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco-Life Technologies | 25300-054 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris-R&D Systems | 1254 | |
| LDN193189 | Stemgent | 04-0074 | |
| SB431542 | Tocris-R&D Systems | 1614 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A4034 | |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD | |
| FGF8 | R&D Systems | 423-F8 | |
| Mouse recombinant sonic hedgehog (SHH) | R&D Systems | 464SH | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| HBSS | Gibco-Life Technologies | 14170-112 | |
| HEPES | Gibco-Life Technologies | 1563-080 | |
| Human recombinant EGF | R&D Systems | 236EG | |
| gelatin (PBS without Mg/Ca) | in house | ||
| Antibodies: | |||
| Anti HNK-1/N-Cam (CD57) mIgM | Sigma | C6680-100TST | lot should be tested |
| Anti-p75 mIgG1 (Nerve Growth factor receptor) | Advanced Targeting Systems | AB-N07 | lot should be tested |
| APC rat anti-mIgM | BD Parmingen | 550676 | lot should be tested |
| AlexaFluor 488 goat anti-mouse IgG1 | Invitrogen | A21121 | lot should be tested |
| Anti Oct4 mIgG2b (used at 1:200 dilution) | Santa Cruz | sc-5279 | lot should be tested |
| Material/Equipment: | |||
| Mouse embryonic fibroblasts (7 million cells/vial) | GlobalStem | GSC-6105M | |
| Cell culture dishes: 10cm and 15 cm plates, centrifuge tubes, FACS tubes, pipetts, pipet tips | |||
| Glass hematocytometer | |||
| Cell culture centrifuge | |||
| Cell culture incubator (CO2, humidity and temperature controlled) | |||
| Cell culture laminar flow hood with embedded microscope | |||
| Cell culture biosafety hood | |||
| Cell sorting machine, i.e. MoFlo | |||
| Inverted microscope | |||
| 1 ml TB syringe 27Gx1/2 | BD Biosciences | 309623 | |
| Cell lifter Polyethylene | Corning Incorporated | 3008 |
Referências
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