Derivazione libero-Feeder della cresta neurale progenitrici Cellule pluripotenti da cellule staminali umane
Summary
Abstract
Le cellule umane staminali pluripotenti (hPSCs) hanno un grande potenziale per lo studio dello sviluppo embrionale umano, per modellare malattie umane nel piatto e come fonte di cellule trapiantabili per applicazioni rigenerative dopo malattie o incidenti. Cresta (NC), le cellule neurali sono i precursori per una grande varietà di cellule somatiche adulte, come le cellule del sistema nervoso periferico e glia, melanociti e cellule mesenchimali. Essi sono una preziosa fonte di cellule per studiare gli aspetti dello sviluppo embrionale umana, inclusa la specificazione destino delle cellule e la migrazione. Ulteriore differenziazione delle cellule progenitrici NC in tipi di cellule terminalmente differenziate offre la possibilità di modellare malattie umane in vitro, studiare meccanismi di malattia e di generare cellule per la medicina rigenerativa. Questo articolo presenta l'adattamento di un protocollo vitro attualmente disponibile nella differenziazione per la derivazione di cellule NC da hPSCs. Questo nuovo protocollo richiede 18 giorni di differentiation, è facilmente scalabile e altamente riproducibile tra cellule staminali embrionali umane (hESC) linee così come cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC) linee privo di alimentatore. Entrambi i protocolli vecchi e nuovi producono celle NC di uguale identità.
Introduction
Le cellule staminali embrionali umane (hESC) e le cellule staminali umane pluripotenti indotte (hiPSC) hanno mostrato un potenziale immenso, in particolare per la ricerca e il trattamento futuro delle malattie umane per i quali sono disponibili né modelli animali buoni né i tessuti primari. Esempi di applicazione per la tecnologia hESC / hiPSC sono i seguenti: Celle di particolare interesse possono essere generati da hESC / hiPSCs per la medicina rigenerativa in quantità illimitata 1. Le cellule possono essere prodotti da pazienti portatori di una malattia specifica e usati per stabilire de modelli di malattia vitro 2,3. Tali modelli di malattia possono poi essere utilizzati per lo screening di stupefacenti su larga scala nella ricerca di nuovi composti farmacologici 4, nonché la sperimentazione di farmaci esistenti per l'efficacia e la tossicità 5. Modelli in vitro di malattia può portare alla identificazione di nuovi meccanismi di malattia. Per tutte le applicazioni della tecnologia hESC / iPSC è importante lavorare con specifici e ben definiretipi d cellule colpite nella malattia di interesse. Pertanto, la disponibilità di protocolli di differenziazione solidi e riproducibili in vitro è fondamentale per tutte le applicazioni della tecnologia hESC / hiPSC. I protocolli sono desiderabili che mostrano la variabilità minima, spese tempo, fatica, difficoltà e costi, nonché la riproducibilità massima tra le linee hESC / hiPSC e diversi ricercatori.
Cresta neurale (NC), le cellule emergono durante neurulazione vertebrati tra l'epidermide e l'epitelio neurale. Essi proliferano e migrano ampiamente in tutto l'embrione in via di sviluppo e danno luogo a una varietà impressionante di tipi di cellule progenie, tra cui ossa / cartilagine, lo scheletro cranio-facciale, nervi sensoriali, cellule di Schwann, melanociti, cellule muscolari lisce, i neuroni enterici, i neuroni autonomici, cellule cromaffini , cellule setto cardiaco, denti e surrenale / tiroide cellule ghiandolari 6. Così, le cellule NC sono un tipo cellulare attraente per il campo delle cellule staminali e importante per lamodellazione di una varietà di malattie, come la malattia di Hirschsprung 7, familiare Disautonomia 8 nonché tumori come il neuroblastoma 9. Inoltre, offrono la possibilità di studiare aspetti dello sviluppo embrionale umano in vitro.
Il attualmente disponibili e ampiamente applicato de protocollo di differenziazione in vitro per la derivazione di cellule NC da hESCs 10,11 richiede fino a 35 giorni di differenziazione e comporta l'induzione neurale delle cellule stromali di alimentazione come le cellule MS5 e viene così eseguita in condizioni scarsamente definiti. Mentre può essere up-scalata a generare grandi quantità di celle NC, ad esempio necessaria per high throughput screening farmacologico 4, questo è il lavoro e costosi. Inoltre, esso comporta passaging manuale di rosette neurali, che possono essere difficili da riprodurre e quindi è soggetta a variabilità complessiva, in particolare quando viene applicato ad una grande varietà di hESC o hiPSClinee. Qui, viene mostrata la derivazione graduale delle cellule NC in un protocollo di 18 giorni che è privo di cellule di alimentazione. Questo metodo è più breve e più definito rispetto al protocollo attualmente utilizzato. Inoltre, è molto robusto nel generare celle NC tra diverse linee hiPSC. Importante, è dimostrato che le cellule CN prodotti dai entrambi i protocolli emergono al confine di rosette neurali (qui di seguito denominato rosetta-NC o R-NC). Le cellule derivate utilizzando uno dei due protocolli appaiono morfologicamente identici, esprimono gli stessi marcatori NC e si raggruppano in analisi di microarray. Celle NC derivate utilizzando il nuovo protocollo (R-NC) sono funzionali, simili alle cellule derivate NC utilizzando il vecchio protocollo (MS5-R-NC) tale che possono migrare e ulteriormente differenziarsi in neuroni. Pertanto, le cellule possono essere usati contemporaneamente con le cellule MS5-R-NC. Il protocollo di cellule R-NC per la derivazione di cellule NC da cellule staminali embrionali umane / iPSC sarà utile per tutte le applicazioni della tecnologia hESC / iPSC che coinvolge il lignaggio NC. </ P>
Protocol
Representative Results
Discussion
Per la differenziazione di successo di cellule R-NC da hESC / hiPSCs devono essere effettuate le seguenti considerazioni. E 'fondamentale per lavorare in condizioni di coltura sterili in ogni momento. In particolare, è importante testare culture HPSC per contaminazione micoplasma regolarmente, poiché questa contaminazione ostacolerà differenziazione successo, ma non può essere facilmente rilevata visivamente in culture HPSC. La differenziazione R-NC deve essere iniziato al 90-100% della densità cellulare; densi…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da una borsa di studio per ricercatori avanzati dal Fondo nazionale svizzero e attraverso sovvenzioni NYSTEM (C026446, C026447) e l'iniziativa di cellule staminali Tri-istituzionale (Starr Foundation).
Materials
| Regents | company | cataloge number | comments |
| DMEM | Gibco-Life Technologies | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| DMEM/F12 | Gibco-Life Technologies | 11330-032 | |
| Knockout Serum Replacement | Gibco-Life Technologies | 10828-028 | Lot should be tested |
| L-Glutamine | Gibco-Life Technologies | 25030-081 | |
| Penicinlin/Streptomycin | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | |
| MEM minimum essential amino acids solution | Gibco-Life Technologies | 11140-050 | |
| β-Mercaptoethanol | Gibco-Life Technologies | 21985-023 | toxic |
| Recombinant human FGF basic (FGF2) | R&D Systems | 233-FB-001MG/CF | |
| Knockout DMEM | Gibco-Life Technologies | 10829-018 | |
| DMEM/F12 powder | Invitrogen | 12500-096 | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| APO human transferrin | Sigma | T1147 | |
| Human insulin | Sigma | A4034 | |
| Putriscine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| Selenite | Sigma | S5261 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Matrigel matrix | BD Biosciences | 354234 | |
| Poly-L Ornithin hydrobromide | Sigma | P3655 | |
| Mouse Laminin-I | R&D Systems | 3400-010-01 | |
| Fibronectin | BD Biosciences | 356008 | |
| Dispase in Hank's Balanced Salt Solution 5U/ml | Stem Cell Technologies | 7013 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco-Life Technologies | 25300-054 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris-R&D Systems | 1254 | |
| LDN193189 | Stemgent | 04-0074 | |
| SB431542 | Tocris-R&D Systems | 1614 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A4034 | |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD | |
| FGF8 | R&D Systems | 423-F8 | |
| Mouse recombinant sonic hedgehog (SHH) | R&D Systems | 464SH | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| HBSS | Gibco-Life Technologies | 14170-112 | |
| HEPES | Gibco-Life Technologies | 1563-080 | |
| Human recombinant EGF | R&D Systems | 236EG | |
| gelatin (PBS without Mg/Ca) | in house | ||
| Antibodies: | |||
| Anti HNK-1/N-Cam (CD57) mIgM | Sigma | C6680-100TST | lot should be tested |
| Anti-p75 mIgG1 (Nerve Growth factor receptor) | Advanced Targeting Systems | AB-N07 | lot should be tested |
| APC rat anti-mIgM | BD Parmingen | 550676 | lot should be tested |
| AlexaFluor 488 goat anti-mouse IgG1 | Invitrogen | A21121 | lot should be tested |
| Anti Oct4 mIgG2b (used at 1:200 dilution) | Santa Cruz | sc-5279 | lot should be tested |
| Material/Equipment: | |||
| Mouse embryonic fibroblasts (7 million cells/vial) | GlobalStem | GSC-6105M | |
| Cell culture dishes: 10cm and 15 cm plates, centrifuge tubes, FACS tubes, pipetts, pipet tips | |||
| Glass hematocytometer | |||
| Cell culture centrifuge | |||
| Cell culture incubator (CO2, humidity and temperature controlled) | |||
| Cell culture laminar flow hood with embedded microscope | |||
| Cell culture biosafety hood | |||
| Cell sorting machine, i.e. MoFlo | |||
| Inverted microscope | |||
| 1 ml TB syringe 27Gx1/2 | BD Biosciences | 309623 | |
| Cell lifter Polyethylene | Corning Incorporated | 3008 |
Referências
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