Derivação sem alimentador de células da crista neural progenitoras pluripotentes humanas de células-tronco
Summary
Abstract
Células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) têm um grande potencial para o estudo do desenvolvimento embrionário humano, para a modelagem de doenças humanas no prato e como fonte de células para transplante para aplicações regenerativas após doença ou acidentes. Células da crista neural (NF) são os precursores para uma grande variedade de células somáticas adultas, tais como células do sistema nervoso periférico e as células gliais, os melanócitos e células mesenquimais. Eles são uma valiosa fonte de células para estudar aspectos do desenvolvimento embrionário humano, incluindo a especificação destino e migração celular. Além disso a diferenciação de células progenitoras NC em tipos de células diferenciados terminalmente oferece a possibilidade de modelar doenças humanas in vitro, investigar os mecanismos da doença e para gerar células medicina regenerativa. Este artigo apresenta a adaptação de um protocolo atualmente disponível em vitro de diferenciação para a derivação de células a partir de NC hPSCs. Este novo protocolo requer 18 dias de diferentiation, é, facilmente escalável e altamente reprodutível entre (hiPSC) linhas humana (hESC) linhas de células estaminais embrionárias, bem como humana induzida de células-tronco pluripotentes sem alimentador. Ambos os antigos e novos protocolos de produzir células NC de igual identidade.
Introduction
Células estaminais embrionárias humanas (hESC) e células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem (hiPSC) mostraram um imenso potencial, em particular para a investigação e tratamento futuro de doenças humanas para as quais nem bons modelos animais nem tecidos primários estão disponíveis. Exemplos de aplicação para a tecnologia de células estaminais embrionárias humanas / hiPSC são os seguintes: Células de interesse particular podem ser gerados a partir de células estaminais embrionárias humanas / hiPSCs para a medicina regenerativa em quantidade ilimitada 1. As células podem ser produzidos a partir de pacientes portadores de uma doença específica e utilizado para estabelecer, em modelos de doenças in vitro, 2,3. Tais modelos de doenças pode ser empregado para a triagem de drogas em grande escala na busca de novos compostos de drogas 4, bem como testes de drogas existentes para a eficácia e toxicidade 5. Em modelos de doenças in vitro podem levar à identificação dos mecanismos da doença da novela. Para todas as aplicações da tecnologia de células estaminais embrionárias humanas / iPSC é importante trabalhar com específica, bem definirtipos d célula afetada na doença de interesse. Assim, a disponibilidade de protocolos de diferenciação in vitro sólidos e reprodutíveis é fundamental para todas as aplicações da tecnologia de células estaminais embrionárias humanas / hiPSC. Protocolos são desejáveis que mostram variabilidade mínima, custa tempo, esforço, dificuldade e custo, bem como a reprodutibilidade máxima entre linhas hESC / hiPSC e diferentes pesquisadores.
Crista neural (NF), as células surgem durante neurulação vertebrado entre a epiderme e o epitélio neural. Eles proliferam e migram extensivamente durante todo o desenvolvimento do embrião, dando origem a uma diversidade impressionante de tipos de células descendentes, incluindo o osso / cartilagem, o esqueleto craniofacial, nervos sensoriais, as células de Schwann, os melanócitos, células musculares lisas, neurônios entéricos, os neurônios autonômicos, células cromafins , células do septo cardíaco, dentes e adrenal / tireóide células glandulares 6. Assim, células de CN são um tipo de célula atraente para o campo de células-tronco e importante para oa modelagem de uma variedade de doenças, tais como a doença de Hirschsprung, 7, disautonomia familiar 8, bem como os cancros, tais como o neuroblastoma 9. Além disso, eles oferecem a possibilidade de estudar os aspectos do desenvolvimento embrionário humano in vitro.
A atualmente disponíveis e amplamente aplicado em protocolo de diferenciação in vitro para a derivação de células da CN de hESCs 10,11 requer até 35 dias de diferenciação e que envolve indução neural em células alimentadoras, como as células do estroma MS5 e é, portanto, realizadas em condições mal definidas. Embora possa ser em maior escala para gerar grandes quantidades de células da CN, por exemplo necessário para high-throughput screening de drogas 4, este é o trabalho e onerosa. Além disso, envolve passaging manual das rosetas neurais, que podem ser difíceis de reproduzir e, portanto, é sujeito a variabilidade global, em particular quando é aplicado a uma grande variedade de células estaminais embrionárias humanas, ou hiPSClinhas. Aqui, a derivação gradual de células NC em um protocolo de 18 dias que está livre de células alimentadoras é mostrado. Este método é mais curto e mais definido do que o protocolo usado atualmente. Além disso, ele é muito robusto na geração de células NC entre diferentes linhas hiPSC. Importante, é mostrado que as células NC gerados por ambos os protocolos surgem na fronteira de rosetas neurais (doravante denominado roseta-NC ou R-NC). As células derivadas utilizando um dos dois protocolos olhar morfologicamente idênticos, eles expressam os mesmos marcadores NC e se agrupam em análise de microarray. Células NC derivadas usando o novo protocolo (R-NC) são funcionais, semelhantes às células NC derivados usando o protocolo de idade (MS5-R-NC) de tal forma que eles podem migrar e diferenciar-se em neurónios mais. Portanto, as células podem ser utilizadas simultaneamente com as células MS5-R-NC. O protocolo de células R-NC para a derivação de células a partir de células estaminais embrionárias humanas NC / iPSC será útil para todas as aplicações da tecnologia hESC / iPSC envolvendo a linhagem NC. </ P>
Protocol
Representative Results
Discussion
Para a diferenciação de células bem sucedida R-NC a partir de células estaminais embrionárias humanas / hiPSCs as seguintes considerações devem ser feitas. É crítico para o trabalho sob condições de cultura estéril em todos os momentos. Em particular, é importante testar culturas HPSC de contaminação por micoplasma regular, uma vez que esta contaminação irá dificultar a diferenciação com êxito, mas não pode ser facilmente detectada visualmente em culturas HPSC. A diferenciação de R-NC deve ser in…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por uma bolsa para pesquisadores avançados da National Science Foundation suíço e através de doações de NYSTEM (C026446; C026447) ea iniciativa de células-tronco Tri-institucional (Fundação Starr).
Materials
| Regents | company | cataloge number | comments |
| DMEM | Gibco-Life Technologies | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| DMEM/F12 | Gibco-Life Technologies | 11330-032 | |
| Knockout Serum Replacement | Gibco-Life Technologies | 10828-028 | Lot should be tested |
| L-Glutamine | Gibco-Life Technologies | 25030-081 | |
| Penicinlin/Streptomycin | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | |
| MEM minimum essential amino acids solution | Gibco-Life Technologies | 11140-050 | |
| β-Mercaptoethanol | Gibco-Life Technologies | 21985-023 | toxic |
| Recombinant human FGF basic (FGF2) | R&D Systems | 233-FB-001MG/CF | |
| Knockout DMEM | Gibco-Life Technologies | 10829-018 | |
| DMEM/F12 powder | Invitrogen | 12500-096 | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| APO human transferrin | Sigma | T1147 | |
| Human insulin | Sigma | A4034 | |
| Putriscine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| Selenite | Sigma | S5261 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Matrigel matrix | BD Biosciences | 354234 | |
| Poly-L Ornithin hydrobromide | Sigma | P3655 | |
| Mouse Laminin-I | R&D Systems | 3400-010-01 | |
| Fibronectin | BD Biosciences | 356008 | |
| Dispase in Hank's Balanced Salt Solution 5U/ml | Stem Cell Technologies | 7013 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco-Life Technologies | 25300-054 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris-R&D Systems | 1254 | |
| LDN193189 | Stemgent | 04-0074 | |
| SB431542 | Tocris-R&D Systems | 1614 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A4034 | |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD | |
| FGF8 | R&D Systems | 423-F8 | |
| Mouse recombinant sonic hedgehog (SHH) | R&D Systems | 464SH | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| HBSS | Gibco-Life Technologies | 14170-112 | |
| HEPES | Gibco-Life Technologies | 1563-080 | |
| Human recombinant EGF | R&D Systems | 236EG | |
| gelatin (PBS without Mg/Ca) | in house | ||
| Antibodies: | |||
| Anti HNK-1/N-Cam (CD57) mIgM | Sigma | C6680-100TST | lot should be tested |
| Anti-p75 mIgG1 (Nerve Growth factor receptor) | Advanced Targeting Systems | AB-N07 | lot should be tested |
| APC rat anti-mIgM | BD Parmingen | 550676 | lot should be tested |
| AlexaFluor 488 goat anti-mouse IgG1 | Invitrogen | A21121 | lot should be tested |
| Anti Oct4 mIgG2b (used at 1:200 dilution) | Santa Cruz | sc-5279 | lot should be tested |
| Material/Equipment: | |||
| Mouse embryonic fibroblasts (7 million cells/vial) | GlobalStem | GSC-6105M | |
| Cell culture dishes: 10cm and 15 cm plates, centrifuge tubes, FACS tubes, pipetts, pipet tips | |||
| Glass hematocytometer | |||
| Cell culture centrifuge | |||
| Cell culture incubator (CO2, humidity and temperature controlled) | |||
| Cell culture laminar flow hood with embedded microscope | |||
| Cell culture biosafety hood | |||
| Cell sorting machine, i.e. MoFlo | |||
| Inverted microscope | |||
| 1 ml TB syringe 27Gx1/2 | BD Biosciences | 309623 | |
| Cell lifter Polyethylene | Corning Incorporated | 3008 |
Referências
- Lee, G., Studer, L. Induced pluripotent stem cell technology for the study of human disease. Nat Methods. 7, 25-27 (2010).
- Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461, 402-406 (2009).
- Ebert, A. D., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457, 277-280 (2009).
- Lee, G., et al. Large-scale screening using familial dysautonomia induced pluripotent stem cells identifies compounds that rescue IKBKAP expression. Nat Biotechnol. 30, 1244-1248 (2012).
- Zimmer, B., et al. Evaluation of developmental toxicants and signaling pathways in a functional test based on the migration of human neural crest cells. Environ Health Perspect. 120, 1116-1122 (2012).
- Dupin, E., Sommer, L. Neural crest progenitors and stem cells: from early development to adulthood. Dev Biol. 366, 83-95 (2012).
- McKeown, S. J., Stamp, L., Hao, M. M., Young, H. M. Hirschsprung disease: a developmental disorder of the enteric nervous system. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2, 113-129 (2013).
- Slaugenhaupt, S. A., et al. Tissue-specific expression of a splicing mutation in the IKBKAP gene causes familial dysautonomia. Am J Hum Genet. 68, 598-605 (2001).
- Cheung, N. K., Dyer, M. A. Neuroblastoma: developmental biology, cancer genomics and immunotherapy. Nat Rev Cancer. 13, 397-411 (2013).
- Lee, G., et al. Isolation and directed differentiation of neural crest stem cells derived from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25, 1468-1475 (2007).
- Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Derivation of neural crest cells from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 5, 688-701 (2010).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
- Itoh, K., et al. Reproducible establishment of hemopoietic supportive stromal cell lines from murine bone marrow. Exp Hematol. 17, 145-153 (1989).
- Barberi, T., et al. Neural subtype specification of fertilization and nuclear transfer embryonic stem cells and application in parkinsonian mice. Nat Biotechnol. 21, 1200-1207 (2003).
- Elkabetz, Y., et al. Human ES cell-derived neural rosettes reveal a functionally distinct early neural stem cell stage. Genes Dev. 22, 152-165 (2008).
- Mica, Y., Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Modeling neural crest induction, melanocyte specification, and disease-related pigmentation defects in hESCs and patient-specific iPSCs. Cell Rep. 3, 1140-1152 (2013).
- Molofsky, A. V., et al. Bmi-1 dependence distinguishes neural stem cell self-renewal from progenitor proliferation. Nature. 425, 962-967 (2003).
