Ф-бесплатно Вывод нервного гребня клеток-предшественников из человеческих плюрипотентных стволовых клеток
Summary
Abstract
Человека плюрипотентные стволовые клетки (hPSCs) имеют большой потенциал для изучения эмбрионального развития человека, для моделирования болезней человека в блюдо и в качестве источника для трансплантации клеток для регенеративной приложений после болезни или несчастного случая. Нервного гребня (NC) клетки являются предшественниками для большого разнообразия взрослых соматических клеток, таких как клетки из периферической нервной системы и глии, меланоцитов и мезенхимальных клеток. Они являются ценным источником клеток для изучения аспектов эмбрионального развития человека, в том числе спецификации клеточных судеб и миграции. Далее дифференциация клеток-предшественников ЧПУ в терминально дифференцированных типов клеток дает возможность моделировать заболевания человека в пробирке, расследовать механизмов болезни и генерировать клетки для регенеративной медицины. Эта статья представляет адаптацию имеющихся в настоящее время в пробирке дифференциации протокола для вывода ЧПУ клеток из hPSCs. Этот новый протокол требует 18 дней Differentiation, является фидерных бесплатно, легко масштабируемой и легко воспроизводимым среди человеческой эмбриональных стволовых клеток (чЭСК) линий, а также человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSC) линий. И старые, и новые протоколы дают NC клетки равной идентичности.
Introduction
Эмбриональные стволовые клетки человека (чЭСК) и человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSC) показали огромный потенциал, в частности, для исследования и дальнейшего лечения болезней человека, для которого ни хорошие модели на животных, ни первичные ткани доступны. Примеры применения для технологии чЭСК / hiPSC являются: Клетки особый интерес могут быть получены из чЭСК / hiPSCs для регенеративной медицины в неограниченном количестве 1. Клетки могут быть получены от пациентов, несущих конкретного заболевания и используется для установления в пробирке моделей заболеваний 2,3. Такие модели болезни затем могут быть использованы для крупномасштабного скрининга лекарственных средств в поисках новых лекарственных соединений 4, а также тестирования существующих препаратов для эффективности и токсичности 5. В пробирке модели болезнь может привести к идентификации механизмов новых заболеваний. Для всех применений технологии чЭСК / IPSC важно работать с конкретными, хорошо определитьтипы г клеток, пострадавших в болезни интересов. Таким образом, наличие твердых и воспроизводимых в пробирке протоколов дифференцировки имеет решающее значение для всех применений технологии чЭСК / hiPSC. Протоколы являются желательно, чтобы показать минимальный изменчивости, расхода времени, усилий сложность и стоимость, а также максимальное воспроизводимость среди чЭСК / hiPSC линий и различных исследователей.
Нервного гребня (NC) клетки появляются во позвоночных нейруляции между эпидермисом и нервной эпителия. Они размножаются и мигрируют по разным странам во развивающегося эмбриона и привести к впечатляющим разнообразием типов потомство клеток, в том числе кости / хряща, черепно-лицевой скелет, чувствительных нервов, клеток Шванн, меланоцитов, клеток гладкой мускулатуры, кишечных нейронов, вегетативные нейроны, хромаффинных клеток , сердечные перегородки клетки, зубы и надпочечников / щитовидной железы железистые клетки 6. Таким образом, NC клетки привлекательным типом клеток в поле стволовой клетки и важен длямоделирование различных заболеваний, таких как болезнь Гиршпрунга 7, семейного Dysautonomia 8, а также рака, таких как нейробластома 9. Кроме того, они предлагают возможность изучать аспекты эмбрионального развития человека в пробирке.
В настоящее время доступны и широко применяется в пробирке протокола дифференцирования выводе NC клеток из ЭСК 10,11 требуется до 35 дней дифференциации, и оно включает нейронной индукцию по стромальных клеток-фидеров, таких как MS5 клеток и, таким образом, выполняется под плохо определенных условиях. Хотя это может быть до масштабных генерировать большое количество NC клеток, например, необходимого для высокопроизводительного скрининга наркотиков 4, это труд и дорогостоящим. Кроме того, оно требует ручного пассирования нейронных розетками, которые могут быть трудно воспроизвести и, таким образом, подлежит общей изменчивости, в частности, когда он применяется к большим разнообразием чЭСК или hiPSCлинии. Здесь, ступенчато вывод NC клеток в 18-дневной протокола, который свободен от фидерных клеток показана. Этот метод является короче и более определенным, чем используемый в настоящее время протокола. Кроме того, он очень надежен в создании NC клетки по различным статьям hiPSC. Важно отметить, что было показано, что клетки NC, полученных в результате обоих протоколов возникают на границе нейронных розетками (далее называется розетка-NC или R-NC). Клетки, полученные с помощью одного из двух протоколов выглядят морфологически идентичны, они выражают те же маркеры ЧПУ и кластер вместе в микрочипов анализа. NC клетки, полученные с помощью нового протокола (R-NC) функциональны, как и NC клеток, полученных с помощью старого протокола (MS5-R-NC), что они могут мигрировать и далее дифференцируются в нейроны. Таким образом, клетки могут быть использованы одновременно с клетками MS5-R-NC. Протокол клеток R-NC для вывода ЧПУ клеток из чЭСК / IPSC будет полезна для всех применений технологии чЭСК / IPSC участием происхождение ЧПУ. </ Р>
Protocol
Representative Results
Discussion
Для успешного дифференциации R-NC клеток из чЭСК / hiPSCs следующие соображения должны быть сделаны. Очень важно, чтобы работать в стерильных условиях культивирования во все времена. В частности, важно, чтобы проверить HPSC культур на загрязнение микоплазмой регулярно, так как это загрязнени?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана стипендией для продвинутых исследователей из Швейцарского национального научного фонда и за счет субсидий из NYSTEM (C026446; C026447) и инициативе Tri-институциональной стволовых клеток (Старр Foundation).
Materials
| Regents | company | cataloge number | comments |
| DMEM | Gibco-Life Technologies | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| DMEM/F12 | Gibco-Life Technologies | 11330-032 | |
| Knockout Serum Replacement | Gibco-Life Technologies | 10828-028 | Lot should be tested |
| L-Glutamine | Gibco-Life Technologies | 25030-081 | |
| Penicinlin/Streptomycin | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | |
| MEM minimum essential amino acids solution | Gibco-Life Technologies | 11140-050 | |
| β-Mercaptoethanol | Gibco-Life Technologies | 21985-023 | toxic |
| Recombinant human FGF basic (FGF2) | R&D Systems | 233-FB-001MG/CF | |
| Knockout DMEM | Gibco-Life Technologies | 10829-018 | |
| DMEM/F12 powder | Invitrogen | 12500-096 | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| APO human transferrin | Sigma | T1147 | |
| Human insulin | Sigma | A4034 | |
| Putriscine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| Selenite | Sigma | S5261 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Matrigel matrix | BD Biosciences | 354234 | |
| Poly-L Ornithin hydrobromide | Sigma | P3655 | |
| Mouse Laminin-I | R&D Systems | 3400-010-01 | |
| Fibronectin | BD Biosciences | 356008 | |
| Dispase in Hank's Balanced Salt Solution 5U/ml | Stem Cell Technologies | 7013 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco-Life Technologies | 25300-054 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris-R&D Systems | 1254 | |
| LDN193189 | Stemgent | 04-0074 | |
| SB431542 | Tocris-R&D Systems | 1614 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A4034 | |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD | |
| FGF8 | R&D Systems | 423-F8 | |
| Mouse recombinant sonic hedgehog (SHH) | R&D Systems | 464SH | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| HBSS | Gibco-Life Technologies | 14170-112 | |
| HEPES | Gibco-Life Technologies | 1563-080 | |
| Human recombinant EGF | R&D Systems | 236EG | |
| gelatin (PBS without Mg/Ca) | in house | ||
| Antibodies: | |||
| Anti HNK-1/N-Cam (CD57) mIgM | Sigma | C6680-100TST | lot should be tested |
| Anti-p75 mIgG1 (Nerve Growth factor receptor) | Advanced Targeting Systems | AB-N07 | lot should be tested |
| APC rat anti-mIgM | BD Parmingen | 550676 | lot should be tested |
| AlexaFluor 488 goat anti-mouse IgG1 | Invitrogen | A21121 | lot should be tested |
| Anti Oct4 mIgG2b (used at 1:200 dilution) | Santa Cruz | sc-5279 | lot should be tested |
| Material/Equipment: | |||
| Mouse embryonic fibroblasts (7 million cells/vial) | GlobalStem | GSC-6105M | |
| Cell culture dishes: 10cm and 15 cm plates, centrifuge tubes, FACS tubes, pipetts, pipet tips | |||
| Glass hematocytometer | |||
| Cell culture centrifuge | |||
| Cell culture incubator (CO2, humidity and temperature controlled) | |||
| Cell culture laminar flow hood with embedded microscope | |||
| Cell culture biosafety hood | |||
| Cell sorting machine, i.e. MoFlo | |||
| Inverted microscope | |||
| 1 ml TB syringe 27Gx1/2 | BD Biosciences | 309623 | |
| Cell lifter Polyethylene | Corning Incorporated | 3008 |
Referências
- Lee, G., Studer, L. Induced pluripotent stem cell technology for the study of human disease. Nat Methods. 7, 25-27 (2010).
- Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461, 402-406 (2009).
- Ebert, A. D., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457, 277-280 (2009).
- Lee, G., et al. Large-scale screening using familial dysautonomia induced pluripotent stem cells identifies compounds that rescue IKBKAP expression. Nat Biotechnol. 30, 1244-1248 (2012).
- Zimmer, B., et al. Evaluation of developmental toxicants and signaling pathways in a functional test based on the migration of human neural crest cells. Environ Health Perspect. 120, 1116-1122 (2012).
- Dupin, E., Sommer, L. Neural crest progenitors and stem cells: from early development to adulthood. Dev Biol. 366, 83-95 (2012).
- McKeown, S. J., Stamp, L., Hao, M. M., Young, H. M. Hirschsprung disease: a developmental disorder of the enteric nervous system. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2, 113-129 (2013).
- Slaugenhaupt, S. A., et al. Tissue-specific expression of a splicing mutation in the IKBKAP gene causes familial dysautonomia. Am J Hum Genet. 68, 598-605 (2001).
- Cheung, N. K., Dyer, M. A. Neuroblastoma: developmental biology, cancer genomics and immunotherapy. Nat Rev Cancer. 13, 397-411 (2013).
- Lee, G., et al. Isolation and directed differentiation of neural crest stem cells derived from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25, 1468-1475 (2007).
- Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Derivation of neural crest cells from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 5, 688-701 (2010).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
- Itoh, K., et al. Reproducible establishment of hemopoietic supportive stromal cell lines from murine bone marrow. Exp Hematol. 17, 145-153 (1989).
- Barberi, T., et al. Neural subtype specification of fertilization and nuclear transfer embryonic stem cells and application in parkinsonian mice. Nat Biotechnol. 21, 1200-1207 (2003).
- Elkabetz, Y., et al. Human ES cell-derived neural rosettes reveal a functionally distinct early neural stem cell stage. Genes Dev. 22, 152-165 (2008).
- Mica, Y., Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Modeling neural crest induction, melanocyte specification, and disease-related pigmentation defects in hESCs and patient-specific iPSCs. Cell Rep. 3, 1140-1152 (2013).
- Molofsky, A. V., et al. Bmi-1 dependence distinguishes neural stem cell self-renewal from progenitor proliferation. Nature. 425, 962-967 (2003).
