İnsan Pluripotent dan Sinir Crest Progenitör Hücreler besleyici ücretsiz Derivasyon Kök Hücre
Summary
Abstract
İnsan pluripotent kök hücreler (hPSCs) tabak içinde, insan hastalıklarının modellemek için hastalık veya kaza sonrası uygulamalarda rejeneratif transplante edilebilir hücre kaynağı olarak, insan embriyo gelişimini incelemek için büyük bir potansiyele sahiptir. Sinir tepe (NC)-hücreleri, periferik sinir sistemi ve glia, melanositler ve mezenkimal hücrelerden hücreler gibi yetişkin somatik hücre, büyük bir çeşitlilik için öncülerdir. Bunlar hücre kaderinin şartname ve göç dahil olmak üzere insan embriyonik gelişim, yönlerini incelemek için hücre değerli bir kaynaktır. Terminal olarak farklılaşmış hücre tipleri NC projenitör hücrelerin farklılaşma başka, in vitro olarak insan hastalıklarının Modele hastalık mekanizmalarını incelemek ve rejeneratif hücrelere ilaç üretmek için imkanı sunar. Bu makalede, hPSCs NC hücrelerinin türetilmesi için bir mevcut in vitro farklılaşma protokol adaptasyonu sunar. Bu yeni protokol sorumluluk yönün 18 gün gerektirirrentiation, besleyici-özgür insan embriyonik kök hücre (HESC) hatları gibi insan uyarılmış pluripotent kök hücre (hiPSC) hatları arasında kolayca ölçeklenebilir ve yüksek tekrarlanabilir olduğunu. Hem eski hem de yeni protokoller eşit kimlik NC hücreleri verim.
Introduction
İnsan embriyonik kök hücreleri (HESC) ve insan uyarılmış pluripotent kök hücreler (hiPSC) iyi hayvan modelleri ne birincil dokular ne mevcut olduğu için insan hastalıkların araştırılması ve gelecekteki tedavisi için özellikle, muazzam bir potansiyel göstermiştir. HESC / hiPSC tekniği Uygulama örnekleri aşağıdaki gibidir: Özellikle ilgi çekici hücreleri sınırsız miktar 1 de rejeneratif tıp için HESC / hiPSCs oluşturulabilir. Hücreler, belirli bir hastalık taşıyan hastaların üretilen ve vitro hastalık modellerinde 2,3 kurmak için kullanılabilir. Bu tür hastalık modelleri daha sonra yeni ilaç bileşikleri 4 arayışı hem de etkinlik ve toksisite 5 için mevcut ilaçların test büyük ölçekli ilaç taraması için kullanılabilecektir. In vitro hastalık modelleri, yeni hastalık mekanizmalarının tanımlanmasına yol açabilir. HESC / iPSC teknolojisinin tüm uygulamalar için spesifik ile çalışmak önemlidir, iyi tanımlamaksöz konusu hastalığın etkilenen d hücre türleri. Bu nedenle, katı ve tekrarlanabilir in vitro farklılaşma protokollerin kullanılabilirliği HESC / hiPSC teknolojisinin tüm uygulamalar için çok önemlidir. Protokoller HESC / hiPSC hatları ve farklı araştırmacılar arasında en az değişkenlik, zaman gider, çaba, zorluk ve maliyet hem de maksimum tekrarlanabilirlik gösteriyor ki arzu edilir.
Nöral krest (NC) hücreleri epidermis ve nöral epiteli arasında omurgalı nörülasyon sırasında ortaya çıkar. , Çoğaldıkları ve gelişen embriyonun boyunca göç eder ve yaygın olarak kemik / kıkırdak, kraniofasiyal iskelet, duyu sinirlerinin, Schwann hücreleri, melanositler, düz kas hücreleri, bağırsak, nöronlar, otonomik nöron, kromafin hücreleri de dahil olmak üzere, soy hücre tiplerinin etkileyici bir çeşitliliği doğuran , kalp septum hücreleri, diş ve adrenal / tiroid salgı bezi hücreleri 6. Bu durumda, hücreler, Kuzey Carolina çekici bir hücre alanı için kök hücre tipi ve için önemlidirBu tür Hirschsprung hastalığı 7, Ailevi Disotonomi 8 yanı sıra 9 gibi nöroblastoma kanser gibi hastalıkların, çeşitli modellenmesi. Dahası, in vitro insan embriyonik gelişim yönlerini incelemek için imkanı sunuyoruz.
Şu anda mevcut ve yaygın olarak hESC 10,11 NC hücrelerinin türetilmesi için vitro farklılaşma protokolünde uygulanan farklılaşma 35 güne kadar sürer ve bu gibi MS5 stromal hücreleri gibi besleyici hücreleri üzerinde uyarılmasını sinir içerir ve bu nedenle yetersiz tanımlanmış koşullar altında gerçekleştirilir. Bu NC hücreleri büyük miktarlarda üretmek için ölçekli kadar olabilir, yüksek verimlilik gösteren ilaç tarama 4 için gerekli olan, örneğin, bu iş ve maliyet yoğundur. Ayrıca, yeniden zor olabilir sinir rozet, elle pasajlanmasını da içerir ve bu HESC veya hiPSC büyük bir çeşitlilik uygulandığı zaman bu nedenle, özellikle genel olarak değişkenlik, tabidirçizgiler. Burada, besleyici hücre içermeyen bir 18 günlük protokolünde NC hücrelerin aşamalı türetme gösterilmiştir. Bu yöntem, şu anda kullanılan protokol daha kısa ve daha belirgin olduğunu. Ayrıca, farklı hiPSC hatları arasında NC hücreleri üreten çok sağlamdır. Önemlisi, bu iki protokol tarafından vermiştir NC hücreler nöral rozetler (bundan sonra adlandırılan rozet-NC ya da R-NC) sınırında ortaya olduğu gösterilmiştir. Iki protokolden birini kullanarak elde edilen hücreler aynı NC işaretleri ifade ve mikroarray analizi birlikte küme, morfolojik aynı görünüyor. Yeni protokolü (R-NC) kullanılarak elde edilen NC hücreleri göç ve daha fazla nöronların içine ayırt olabilir böyle eski protokolü (MS5-R-NC) kullanılarak elde edilen NC hücrelerine benzer, işlevseldir. Bu yüzden, hücreler, MS5-R-NC hücreleri ile eş zamanlı olarak kullanılabilir. HESC / iPSC NC hücrelerin derivasyon için R-NC hücre protokol NC soy içeren HESC / iPSC teknolojisinin tüm uygulamalar için faydalı olacaktır. </ P>
Protocol
Representative Results
Discussion
HESC / hiPSCs R-NC hücrelerinin başarılı farklılaşması için aşağıdaki noktalar göz önüne alınmalıdır. Bu her zaman steril kültür koşulları altında çalışmak için çok önemlidir. Özellikle, bu kirlenme başarılı engel farklılaşmasını çünkü, düzenli mikoplazma kontaminasyonu için hPSC kültürleri test etmek önemlidir, ancak kolayca hPSC kültürde görsel olarak tespit edilemez. R-NC farklılaşması% 90-100 hücre yoğunluğunda başlanmalıdır; düşük hücre yoğunluğu, hücre…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ve Tri-kurumsal kök hücre girişimi (Starr Vakfı); Bu çalışma İsviçre Ulusal Bilim Vakfı ve NYSTEM (C026447 C026446) hibe yoluyla ileri araştırmacılar için bir burs ile desteklenmiştir.
Materials
| Regents | company | cataloge number | comments |
| DMEM | Gibco-Life Technologies | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| DMEM/F12 | Gibco-Life Technologies | 11330-032 | |
| Knockout Serum Replacement | Gibco-Life Technologies | 10828-028 | Lot should be tested |
| L-Glutamine | Gibco-Life Technologies | 25030-081 | |
| Penicinlin/Streptomycin | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | |
| MEM minimum essential amino acids solution | Gibco-Life Technologies | 11140-050 | |
| β-Mercaptoethanol | Gibco-Life Technologies | 21985-023 | toxic |
| Recombinant human FGF basic (FGF2) | R&D Systems | 233-FB-001MG/CF | |
| Knockout DMEM | Gibco-Life Technologies | 10829-018 | |
| DMEM/F12 powder | Invitrogen | 12500-096 | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| APO human transferrin | Sigma | T1147 | |
| Human insulin | Sigma | A4034 | |
| Putriscine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| Selenite | Sigma | S5261 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Matrigel matrix | BD Biosciences | 354234 | |
| Poly-L Ornithin hydrobromide | Sigma | P3655 | |
| Mouse Laminin-I | R&D Systems | 3400-010-01 | |
| Fibronectin | BD Biosciences | 356008 | |
| Dispase in Hank's Balanced Salt Solution 5U/ml | Stem Cell Technologies | 7013 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco-Life Technologies | 25300-054 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris-R&D Systems | 1254 | |
| LDN193189 | Stemgent | 04-0074 | |
| SB431542 | Tocris-R&D Systems | 1614 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A4034 | |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD | |
| FGF8 | R&D Systems | 423-F8 | |
| Mouse recombinant sonic hedgehog (SHH) | R&D Systems | 464SH | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| HBSS | Gibco-Life Technologies | 14170-112 | |
| HEPES | Gibco-Life Technologies | 1563-080 | |
| Human recombinant EGF | R&D Systems | 236EG | |
| gelatin (PBS without Mg/Ca) | in house | ||
| Antibodies: | |||
| Anti HNK-1/N-Cam (CD57) mIgM | Sigma | C6680-100TST | lot should be tested |
| Anti-p75 mIgG1 (Nerve Growth factor receptor) | Advanced Targeting Systems | AB-N07 | lot should be tested |
| APC rat anti-mIgM | BD Parmingen | 550676 | lot should be tested |
| AlexaFluor 488 goat anti-mouse IgG1 | Invitrogen | A21121 | lot should be tested |
| Anti Oct4 mIgG2b (used at 1:200 dilution) | Santa Cruz | sc-5279 | lot should be tested |
| Material/Equipment: | |||
| Mouse embryonic fibroblasts (7 million cells/vial) | GlobalStem | GSC-6105M | |
| Cell culture dishes: 10cm and 15 cm plates, centrifuge tubes, FACS tubes, pipetts, pipet tips | |||
| Glass hematocytometer | |||
| Cell culture centrifuge | |||
| Cell culture incubator (CO2, humidity and temperature controlled) | |||
| Cell culture laminar flow hood with embedded microscope | |||
| Cell culture biosafety hood | |||
| Cell sorting machine, i.e. MoFlo | |||
| Inverted microscope | |||
| 1 ml TB syringe 27Gx1/2 | BD Biosciences | 309623 | |
| Cell lifter Polyethylene | Corning Incorporated | 3008 |
Referências
- Lee, G., Studer, L. Induced pluripotent stem cell technology for the study of human disease. Nat Methods. 7, 25-27 (2010).
- Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461, 402-406 (2009).
- Ebert, A. D., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457, 277-280 (2009).
- Lee, G., et al. Large-scale screening using familial dysautonomia induced pluripotent stem cells identifies compounds that rescue IKBKAP expression. Nat Biotechnol. 30, 1244-1248 (2012).
- Zimmer, B., et al. Evaluation of developmental toxicants and signaling pathways in a functional test based on the migration of human neural crest cells. Environ Health Perspect. 120, 1116-1122 (2012).
- Dupin, E., Sommer, L. Neural crest progenitors and stem cells: from early development to adulthood. Dev Biol. 366, 83-95 (2012).
- McKeown, S. J., Stamp, L., Hao, M. M., Young, H. M. Hirschsprung disease: a developmental disorder of the enteric nervous system. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2, 113-129 (2013).
- Slaugenhaupt, S. A., et al. Tissue-specific expression of a splicing mutation in the IKBKAP gene causes familial dysautonomia. Am J Hum Genet. 68, 598-605 (2001).
- Cheung, N. K., Dyer, M. A. Neuroblastoma: developmental biology, cancer genomics and immunotherapy. Nat Rev Cancer. 13, 397-411 (2013).
- Lee, G., et al. Isolation and directed differentiation of neural crest stem cells derived from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25, 1468-1475 (2007).
- Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Derivation of neural crest cells from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 5, 688-701 (2010).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
- Itoh, K., et al. Reproducible establishment of hemopoietic supportive stromal cell lines from murine bone marrow. Exp Hematol. 17, 145-153 (1989).
- Barberi, T., et al. Neural subtype specification of fertilization and nuclear transfer embryonic stem cells and application in parkinsonian mice. Nat Biotechnol. 21, 1200-1207 (2003).
- Elkabetz, Y., et al. Human ES cell-derived neural rosettes reveal a functionally distinct early neural stem cell stage. Genes Dev. 22, 152-165 (2008).
- Mica, Y., Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Modeling neural crest induction, melanocyte specification, and disease-related pigmentation defects in hESCs and patient-specific iPSCs. Cell Rep. 3, 1140-1152 (2013).
- Molofsky, A. V., et al. Bmi-1 dependence distinguishes neural stem cell self-renewal from progenitor proliferation. Nature. 425, 962-967 (2003).
